一种量子点–抗体免疫复合物的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种量子点–抗体免疫复合物的制备方法，制备方法包括如下步骤：1）使羧基修饰的量子点与激活剂在0‑10℃下、在pH值为5‑6的缓冲液中反应，生成活化量子点；其中，激活剂包括1‑乙基‑3‑(3‑二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N‑羟基琥珀酰亚胺或其硫代物；2）使步骤1）制备的活化量子点与抗体在0‑10℃下、在pH值为6‑9的缓冲液中反应，制成量子点–抗体免疫复合物；本发明专利技术能够实现量子点–抗体免疫复合物具有较强的荧光强度和生物活性等特性，而且还能实现偶联率可达90%左右，进而大大地提升了原料的利用率，有利于大规模的应用。

Preparation of a Quantum Dot-Antibody Immune Complex

The invention discloses a preparation method of a quantum dot-antibody immune complex. The preparation method comprises the following steps: 1) reacting a carboxyl modified quantum dot with an activator at 0 10 C in a buffer solution with a pH value of 5 6 to generate an activated quantum dot; and the activator comprises 1 ethyl 3 (3 dimethylaminopropyl) Carbide diimide hydrochloride, N hydroxy succinimide or its thiosulfonates; 2) The activated quantum dots prepared in step 1 react with antibodies in a buffer solution with pH 6 9 at 0 10 C to form a quantum dot-antibody immune complex; The present invention can realize that the quantum dot-antibody immune complex has strong fluorescence. Moreover, the coupling rate can reach about 90%, which greatly improves the utilization of raw materials and is conducive to large-scale application.

【技术实现步骤摘要】
一种量子点–抗体免疫复合物的制备方法
本专利技术属于生物标记领域，具体涉及一种量子点–抗体免疫复合物的制备方法。
技术介绍
量子点(Quantumdots,QDs)是主要由ⅡB族～ⅥA族元素(如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等)或ⅢA族～ⅤA族元素(如InP、InAs等)构成的半导体纳米颗粒。自80年代发现合成以来，由于其特殊的荧光特性等，具体诸如：1)尺寸控制发射光谱，颜色可调，可实现同种量子点多色标记；2)激发光谱宽，发射光谱窄而对称；3)较大的斯托克斯位移；4)光化学稳定性高，耐光漂白；5)荧光效率高；6)生物相容性好；7)荧光寿命长等等，因此可扩展应用于生物标记。目前，量子点作为新型的纳米材料，其生物荧光标记的制备方法分为非共价连接和共价连接。其中非共价连接主要有静电吸附、特异性生物靶标连接、链霉素-生物素连接等；共价连接包括量子点表面功能基团羧基、氨基、羟基等，在不同激活剂的活化下分别与生物分子的氨基、巯基等共价连接。其中量子点表面羧基与生物分子氨基共价连接(即量子点-抗体免疫复合物)应用最为广泛。现有技术中制备量子点-抗体免疫复合物的方法不一，导致了偶联效率差别较大，制备成本增加。目前主流的制备方法为：先与激活剂反应，再与特定抗体结合进而制备得到量子点-抗体免疫复合物；然而按照目前的具体制备方法中制得的量子点-抗体免疫复合物，其偶联率普遍偏低，较为浪费原料，不利于大规模的生产，进而限制了其在生物荧光标记中的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的量子点–抗体免疫复合物的制备方法，其能够实现量子点–抗体免疫复合物具有较强的荧光强度和生物活性等特性，而且还能实现偶联率可达90％左右，进而大大地提升了原料的利用率，有利于大规模的应用。为解决以上技术问题，本专利技术采取的技术方案如下：一种量子点–抗体免疫复合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：1)使羧基修饰的量子点与激活剂在0-10℃下、在pH值为5-6的缓冲液中反应，生成活化量子点；其中，所述激活剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或其硫代物；2)使步骤1)制备的所述活化量子点与抗体在0-10℃下、在pH值为6-9的缓冲液中反应，制成所述量子点–抗体免疫复合物。根据本专利技术的一些优选方面，步骤1)中，所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、所述N-羟基琥珀酰亚胺或其硫代物、所述羧基修饰的量子点的投料摩尔比为1000～10000︰1000～10000︰1。根据本专利技术，所述羧基修饰的量子点可为核壳型或非核壳型量子点。根据本专利技术的一些优选方面，所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或其硫代物的添加方式以溶液形式加入，即先将1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或其硫代物通过硼酸-硼砂缓冲溶液配制成pH值为5-6的溶液，再根据配方量加入。根据本专利技术的一些优选方面，步骤1)中，控制所述反应在0-5℃下进行。根据本专利技术的一些优选方面，步骤2)中，所述反应在0-5℃下进行。根据本专利技术的一些优选方面，所述制备方法中，分别控制所述步骤1)和所述步骤2)的反应在超声条件下进行。根据本专利技术的一些优选方面，步骤2)中，所述活化量子点与所述抗体的投料摩尔比为1︰5-15。根据本专利技术的一些优选方面，所述制备方法中，所述步骤1)和所述步骤2)中pH值分别通过硼酸-硼砂缓冲溶液来调节。实际过程中，可根据需要调节的pH值灵活调整硼酸与硼砂的加入量，进而可以控制调节酸性还是碱性等。根据本专利技术的一些优选方面，所述抗体为小鼠抗人C反应蛋白单克隆抗体(anti-CRP-C6)。根据本专利技术的一些优选方面，所述步骤2)的具体实施方式为：将步骤1)反应后得到的含有活化量子点的反应液置于超滤管中，在0-10℃下离心，然后加入硼酸-硼砂缓冲溶液调节pH值，再次离心，制得pH值为6-9的含有活化量子点的粗提溶液，然后将抗体加入所述粗提溶液中，在0-10℃下反应，制成所述量子点–抗体免疫复合物。根据本专利技术的一些优选方面，所述超滤管的截留分子量为100kd。根据本专利技术的一些优选方面，所述制备方法还包括：步骤3)将步骤2)反应后得到的反应混合液置于透析袋内透析，浓缩，即可得纯化的量子点–抗体免疫复合物。实际过程中，量子点以溶液形式存在，因此，提纯浓缩后制得的为含有量子点-抗体免疫复合物的溶液。根据本专利技术的一些优选方面，所述透析袋的截留分子量为300kd。由于以上技术方案的采用，本专利技术与现有技术相比具有如下优点：本专利技术通过使量子点与激活剂，以及活化后的量子点与抗体在特定的反应温度以及pH值环境下反应，避免了现有技术中在制备过程中发生的量子点荧光性淬灭，和/或，生成的复合物发生攒聚而分散不均匀进而易粘附在反应容器的器壁上，从而导致失活失效，本专利技术特定方法制备的量子点-抗体免疫复合物则具有较强的荧光强度、抗体特异性的生物活性、分子量增加、表面电位降低，而且偶联率得到了极大地提升，有利于大规模生产。同时通过本专利技术特定的纯化方法，可简单地分离出与抗体反应后的量子点溶液与未反应的抗体溶液，且可避免现有技术中使用大型昂贵的仪器才能完成的弊端。附图说明图1为量子点对照与实施例1中的量子点-抗体免疫复合物的琼脂糖凝胶电泳图；图2为量子点对照与实施例1中的量子点-抗体免疫复合物斑点杂交验证图；图3为量子点对照与实施例1中的量子点-抗体免疫复合物荧光光谱图。具体实施方式目前，现有技术中，基于量子点特殊的荧光特性等优异性能，其被应用于生物荧光标记的实例越来越多，其中尤以量子点表面羧基与生物分子氨基共价连接应用(量子点-抗体免疫复合物)最为广泛，目前量子点-抗体免疫复合物的制备方法中主要的方法为：量子点先与激活剂反应，再与抗体结合进而制备得到量子点-抗体免疫复合物，然而，以目前具体制备条件下制成的复合物，其不仅偶联率较低，而且存在荧光淬灭，或分散不均匀进而易粘附在反应容器的器壁上的问题，从而会导致失活失效，因此，不利于节约成本以及大规模生产，进而限制了量子点-抗体免疫复合物在荧光标记中的大规模应用。经研究发现，当控制活化的反应在低温尤其是0-10℃下、pH值为5-6，以及控制与抗体的结合反应同样在0-10℃下时进行反应时，可以极大地提升偶联率，并且可避免荧光淬灭、生成物粘附器壁等现象的发生，从而可最大化地利用原料，降低生产成本，有利于工业化大规模的应用。基于此，本申请提供了一种量子点–抗体免疫复合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：1)使羧基修饰的量子点与激活剂在0-10℃下、在pH值为5-6的缓冲液中反应，生成活化量子点；其中，所述激活剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或其硫代物；2)使步骤1)制备的所述活化量子点与抗体在0-10℃下、在pH值为6-9的缓冲液中反应，制成所述量子点–抗体免疫复合物。上述通过使量子点与激活剂，以及活化后的量子点与抗体在特定的反应温度以及pH值环境下反应，避免了现有技术中在制备过程中发生的量子点荧光性淬灭，和/或，生成的复合物发生攒聚而分散不均匀进而易粘附在反应容器的器壁上，从而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种量子点–抗体免疫复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：1）使羧基修饰的量子点与激活剂在0‑10℃下、在pH值为5‑6的缓冲液中反应，生成活化量子点；其中，所述激活剂包括1‑乙基‑3‑(3‑二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N‑羟基琥珀酰亚胺或其硫代物；2）使步骤1）制备的所述活化量子点与抗体在0‑10℃下、在pH值为6‑9的缓冲液中反应，制成所述量子点–抗体免疫复合物。

【技术特征摘要】
1.一种量子点–抗体免疫复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：1）使羧基修饰的量子点与激活剂在0-10℃下、在pH值为5-6的缓冲液中反应，生成活化量子点；其中，所述激活剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或其硫代物；2）使步骤1）制备的所述活化量子点与抗体在0-10℃下、在pH值为6-9的缓冲液中反应，制成所述量子点–抗体免疫复合物。2.根据权利要求1所述的量子点–抗体免疫复合物的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、所述N-羟基琥珀酰亚胺或其硫代物、所述羧基修饰的量子点的投料摩尔比为1000~10000︰1000~10000︰1。3.根据权利要求1所述的量子点–抗体免疫复合物的制备方法，其特征在于，步骤1）中，控制所述反应在0-5℃下进行。4.根据权利要求1所述的量子点–抗体免疫复合物的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述反应在0-5℃下进行。5.根据权利要求1所述的量子点–抗体免疫复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，分别控制所述步骤1）和所述步骤2）的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李嫚莉，李超，胡延祯，
申请(专利权)人：西安交通大学苏州研究院，
类型：发明
国别省市：江苏,32