纳米金笼复合物及其在制备检测人尿液或血液中的cMyBP-C的试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种纳米金笼复合物及其制备方法和在制备检测人尿液或血液中的cMyBP‑C试剂盒中的应用。纳米金笼复合物与一对抗人心肌球蛋白C单抗BT09和BT10共价结合，形成快速检测人尿液或血液中的cMyBP‑C的试剂盒。本发明专利技术使用纳米金笼复合物代替目前胶体金试纸条常用的球形纳米颗粒。应用于人血和/或尿cMyBP‑C检测敏感性和特异性极高，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒产生更好的分辨光信号。应用特定条件下（形状、尺寸）正方体中空纳米晶体与DNA和蛋白质共价键结合机制，生物素标记的单链DNA连接二种尺寸的纳米抗体，较胶体金纳米球POCT产品增强检测信号达5000~10000倍。结果易观察，灵敏度达到100fg/mL，15分钟内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性。

Nano-gold cage complex and its application in the preparation of cMyBP-C kit for detection of human urine or blood

The invention discloses a nano gold cage complex and a preparation method thereof, and its application in the preparation of a cMyBP C kit for detecting human urine or blood. The gold nanocage complex covalently binds with a monoclonal antibody to human cardiomyoglobulin C (BT09) and BT10 to form a rapid detection kit for cMyBP_C in human urine or blood. The present invention uses nano gold cage composite instead of spherical nanoparticles commonly used in colloidal gold strips. The detection of cMyBP_C in human blood and/or urine has high sensitivity and specificity, and can produce better resolution optical signals than spherical gold nanoparticles under white background. Using the mechanism of covalent bonding of cubic hollow nanocrystals with DNA and protein under specific conditions (shape and size), biotin-labeled single-stranded DNA was used to link two kinds of nano-antibodies. The enhanced detection signal of biotin-labeled single-stranded DNA was 5000-10000 times higher than that of colloidal gold nanosphere POCT products. The results were easy to observe, the sensitivity reached 100 fg/mL, and the results could be interpreted within 15 minutes, which had good stability and repeatability.

【技术实现步骤摘要】
纳米金笼复合物及其在制备检测人尿液或血液中的cMyBP-C的试剂盒中的应用
本专利技术属于生物技术应用领域，具体涉及一种纳米金笼复合物及其制备方法和应用，尤其涉及该纳米金笼复合物在制备血和/或尿液心脏肌球蛋白结合蛋白C检测试纸条方面的应用。
技术介绍
急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)和/或损伤(myocardialinjury,MCI)是一类高发病率的临床重大疾病。欧美、中国乃至全球人群中AMI、MCI的死亡率、住院和就诊花费均居前列。心肌坏死生物标志物心肌肌钙蛋白(cTn)T/I是目前诊断AMI、危险度分层的首选标志物(NatRevCardiol.2012Nov；9(11):620-633)。但值得注意的是，血液cTn浓度是在心肌损伤后6-8小时才开始增高，16-18小时左右达峰值，因此胸痛发作时间＜6h的AMI患者，其cTn升高并不明显，缺乏诊断敏感性。近年新一代高敏感方法检测cTn(hs-cTn)相继问世，引起关注，可在胸痛＜3h检测增高，但因新一代高敏感方法可在大约99％的表面健康人群中也可观察到，增高了假阳性结果(SwissMedWkly.2011May10；141:w13202.InternEmergMed.2017Mar；12(2):147-155.中华内科杂志2015,54(10):899-904)。其他如长跑、肾脏疾病等非心脏因素也可以引起cTn增高。目前其他心肌损伤生物标志物如肌红蛋白、CK-MB等缺乏敏感性或者特异性。在此背景下，寻找特异性更高、出现时间更早的AMI标志物具有十分重要的临床意义。心脏肌球蛋白结合蛋白C(cMyBP-C)是心脏组织含量最丰的蛋白质之一(位列心脏2300个蛋白质的第19位)，其总量分别是心脏cTnI及cTnT2倍多(cTnI及cTnT分别位列第118位及92位，MolCellProteomics.2009Dec；8(12):2687-99)。cMyBP-C的分子量约140KD，位于心肌粗肌丝肌球蛋白头部的横桥处，是调节心肌收缩的关键蛋白质。cMyBP-C蛋白质N端与其他横纹肌肌球蛋白结合蛋白C不同，是心脏组织特异表达。急性心肌损伤、AMI状态下，心肌受损，其N端约40KD片断释放入血，从而使得血液cMyBP-C浓度升高，cMyBP-C成为自cTn以来最有前途的心肌损伤生物标志物。
技术实现思路
专利技术目的：为达到从AMI和/或急性心肌损伤病人血液和/尿液中快速检测cMyBP-C的目的，近年即时检验(point-of-caretesting,POCT)快速检测心脏标志物发展迅速，包括胶体金技术，采用免疫层析双抗体夹心法原理，利用胶体金可以牢固吸附在抗体的表面而不影响抗体的活性，当标记抗体与抗原反应聚集到一定浓度时，可以直接呈现颜色，可直接定性进行标志物浓度判断，结合专用阅读仪可达到半定量结果。整个检测过程可控制在15分钟内。目前尚无cMyBP-C快速检测试剂盒的专利或产品。技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种纳米金笼复合物，所述纳米金笼复合物是通过中空正方体金纳米粒子与特定单链DNA以及显色抗体鼠抗人cMyBP-C抗体BT09相连接而成的复合物。其中，上述特定单链DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或SEQIDNO:4。其中，上述纳米金笼标记物包含有显色抗体鼠抗人cMyBP-C抗体BT09。其中，上述特定单链DNA长度为30-80bp，特定单链DNA3'端标有生物素，特定单链DNA5’端连有巯基。其中，上述纳米金笼复合物的尺寸为10-16nm和40-60nm。本
技术实现思路
还包括一种纳米金笼复合物的制备方法，包括以下步骤：1)纳米金笼溶液的制备：用去离子水制备HAuCl4溶液，在室温下用注射泵在HAuCl4溶液中逐滴加入柠檬酸，之后在继续搅拌的情况下，待颜色变为红色离心去除上清，获得不同尺寸的中空正方体金纳米晶体，然后用去离子水重悬中空正方体金纳米晶体，离心除过多的Au3+离子，去离子水重悬沉淀，加入5～20mg/mlPVP单体及0.1％Tween得到纳米金笼溶液；2)用0.1MK2CO3调节纳米金笼溶液pH8.5-9.0；将特定单链DNA与纳米金笼溶液联接反应6-8小时，加进PVP单体使其终浓度为0.2-1.0％，用2MNaCl，20mMphosphate调节pH至7.4得到纳米金标记复合物；3)纳米金笼复合物的制备：用K2CO3调节纳米金标记复合物至pH为7.4-9.0，于纳米金标记复合物中逐滴加入显色抗体鼠抗人cMyBP-C抗体BT09得到纳米金笼复合物。本
技术实现思路
还包括所述的纳米金笼复合物在检测人尿液或血液中的cMyBP-C中的应用。本
技术实现思路
还包括一种心脏肌球蛋白结合蛋白C检测试纸条，所述检测试纸条上设有所述的纳米金笼复合物。本
技术实现思路
还包括心脏肌球蛋白结合蛋白C检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：1)纳米金笼复合物的制备：按照上述的方法制备纳米金笼复合物；2)纳米材料垫制备及喷垫：将纳米金笼复合物喷印在纳米材料垫上；3)检测线制备：将单克隆抗体BT10划在醋酸纤维膜上，制成检测线；4)质控线制备：将羊抗鼠IgG抗体划在醋酸纤维膜上，制成质控线；5)试纸条装配；6)检测。有益效果：本专利技术使用纳米金笼复合物代替目前胶体金试纸条常用的球形纳米颗粒。应用于人血和/或尿cMyBP-C检测，敏感性和特异性极高，特异性能到达95％以上，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒产生更好的分辨光信号。本专利技术使用纳米金笼复合物代替目前胶体金试纸条常用的球形纳米颗粒。应用于人血和/或尿cMyBP-C检测敏感性和特异性极高，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒产生更好的分辨光信号。应用特定条件下(形状、尺寸)正方体中空纳米晶体与DNA和蛋白质共价键结合机制，生物素标记的单链DNA连接二种尺寸的纳米抗体，较胶体金纳米球POCT产品增强检测信号达5000～10000倍。结果易观察，灵敏度达到10Fg/mL，15分钟内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性。操作简便，无需特殊仪器设备，可应用于各种原因导致的急性心肌损伤的早期诊断、危险度分层及治疗效果评判。尤其适宜在广大基层医院推广和应用。具体实施方式本实验用到的材料：检测线抗体为抗人cMyBP-C单克隆抗体BT10为捕捉抗体(金斯瑞生物科技购买、货号2G2F3)，质控线抗体为羊抗鼠IgG，鼠抗人cMyBP-C抗体BT09(金斯瑞生物科技购买、货号9B11C5)。特定单链DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或SEQIDNO:4由本公司设计合成制得。其他材料均自市场上购买。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1：纳米金笼复合物的制备1)纳米金笼溶液的制备：用去离子水制备HAuCl4溶液，在室温下用注射泵在HAuCl4溶液中逐滴加入柠檬酸，之后在继续搅拌的情况下，待颜色变为红色离心去除上清，获得不同尺寸的正方体中空纳米晶体，然后用去离子水重悬正方体中空纳米晶体，离心除过多的Au3+离子，去离子水重悬沉淀，加入5mg/mlPVP单体及0.1％Tween得到纳米金笼溶液；该正方体中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米金笼复合物，其特征在于，所述纳米金笼复合物是通过中空正方体金纳米粒子与特定单链DNA以及显色抗体鼠抗人cMyBP‑C抗体BT09相连接而成的复合物。

【技术特征摘要】
1.一种纳米金笼复合物，其特征在于，所述纳米金笼复合物是通过中空正方体金纳米粒子与特定单链DNA以及显色抗体鼠抗人cMyBP-C抗体BT09相连接而成的复合物。2.根据权利要求1所述的纳米金笼复合物，其特征在于，所述特定单链DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或SEQIDNO:4。3.根据权利要求1所述的纳米金笼复合物，其特征在于，所述纳米金笼标记物包含有显色抗体鼠抗人cMyBP-C抗体BT09。4.根据权利要求1所述的纳米金笼复合物，其特征在于，所述特定单链DNA长度为30-80bp，特定单链DNA3'端标有生物素，特定单链DNA5’端连有巯基。5.根据权利要求1所述的纳米金笼复合物，其特征在于，所述纳米金笼复合物的尺寸为10-16nm和40-60nm。6.权利要求1~5任一项所述的纳米金笼复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）纳米金笼溶液的制备：用去离子水制备HAuCl4溶液，在室温下用注射泵在HAuCl4溶液中逐滴加入柠檬酸，之后在继续搅拌的情况下，待颜色变为红色后离心去除上清，获得不同尺寸的中空正方体金纳米晶体，然后用去离子水重悬中空正方体金纳米晶体，离心除过多的Au3+离子，去离子水重悬沉...

【专利技术属性】
技术研发人员：张寄南，张雷，
申请(专利权)人：南京博天科智生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32