本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法，属于水稻育种技术领域，涉及应用水稻甜菜醛脱氢酶基因BADH2创制香稻的方法。在香稻中，BADH2基因功能缺失，造成化学物质2‑乙酰‑1‑吡咯啉(2‑AP)积累而产生香味，所述CRISPR/Cas9系统采用的sgRNA引导序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的任一序列。使用本发明专利技术方法，能够成功敲除BADH2基因，快速创制香稻。方法操作简单，省时省力，缩短香稻育种年限。
【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法
本专利技术涉及水稻育种
，具体是一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法。
技术介绍
香味是水稻的重要品质指标之一，主要受第8染色体上的一对隐性基因(BADH2)控制，在香稻中，BADH2基因功能缺失，造成化学物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)积累而产生香味。目前，水稻香味改良主要通过杂交育种和基因工程育种。在杂交选育过程中，需要进行大量的反复多代回交或者自交，才能选育出综合性状优良且纯和的香稻材料，育种周期长，工作量大。基因工程育种开辟了水稻育种的新途径，突破物种间的界限，缩短育种进程。RNAi技术和基因组编辑技术是重要的基因工程育种方法。RNAi技术利用体外合成的短双链RNA抑制细胞内BADH2基因的表达，快速获得香味水稻[NiuXL,TangW,HuangWZ,etal.RANi-directeddownregulationofOsBADH2resultsinaroma(2-acetyl-1-pyrroline)productioninrice(OryzasativaL.).BMCPlantBiol,2008,8:10；ChenMl,WeiXJ,ShaoGN,TangSQ,etal.FragranceofthericegrainachievedviaartificialmicroRNA-induceddown-regulationofOsBADH2.PlantBreeding,2012,131:584-590.]，然而RNAi主要靶标成熟的RNA，是一种基因下调方法，无法完全去除基因功能。基因编辑技术主要包括锌脂核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)及CRISPR系统[Gaj,T.,etal.ZFN,TALEN,andCRISPR/Cas-basedmethodsforgenomeengineering.TrendsBiotechnol,2013,31(7):397-405]。CRISPR/Cas9是目前使用最为广泛且最为高效的基因组编辑系统，与ZFN和TALEN技术相比，操作更简单，成本更低。CRISPR/Cas9系统由两部分组成，即Cas9蛋白(一种核酸酶)和sgRNA(引导Cas9蛋白至靶位点的向导序列)，欲敲除某个基因时，只需设计sgRNA上针对靶基因处特异的20bp碱基序列即可，该系统已成功应用于水稻基因组编辑。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的不足，适应现实发展，提供一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法，利用CRISPR/Cas9系统对普通水稻中的BADH2基因进行定点敲除，所述BADH2基因DNA序列如SEQIDNo.1所示，或为与SEQIDNo.1所示序列存在90％以上序列相似性的序列。进一步，所述CRISPR/Cas9系统采用的sgRNA引导序列为SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的任一序列。进一步，所述BADH2基因转化子如SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示序列位点的突变，采用如下引物检测：U3/U6-F：5’-AGCCTTCCAGTCTAAATGACAGTAA-3’U3/U6-R：5’-GCTGCTAGGTACAATTTGTGAGACA-3’上述的利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法，包括如下步骤：(1)设计基于BADH2基因的sgRNA序列；(2)设计并合成sgRNA引物；(3)引物退火成双链；(4)连接；(5)转化大肠杆菌；(6)提取质粒；(7)凝胶电泳及测序；(8)转化农杆菌；(9)转化愈伤组织；(10)对转化子中BADH2基因的敲除效果进行检测；(11)突变判定；(12)香味物质2-AP相对定量分析；(13)观察突变体农艺性状。进一步，所述步骤(10)对转化子中BADH2基因的敲除效果进行检测：提取T0代叶片DNA，利用引物U3/U6-F(AGCCTTCCAGTCTAAATGACAGTAA)和U3/U6-R(GCTGCTAGGTACAATTTGTGAGACA)对转化子BADH2基因DNA中SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所在位点序列进行PCR扩增，将获得的PCR产物目标片段克隆至pMD-18-T载体，转化大肠杆菌，挑取单克隆测序，测10个单克隆以上，保证获得5个以上阳性克隆。更进一步，PCR扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，共32个循环；最后72℃延伸2min。本专利技术的优点和积极效果：1、使用本专利技术，能够成功敲除BADH2基因，快速创制香稻。2、方法操作简单，省时省力，缩短香稻育种年限。附图说明图1：通过CRISPR/Cas9定点敲除获得的BADH2基因突变植株的靶序列突变情况；其中，WT-U6表示SEQIDNo.2对应的野生型BADH2基因的位点附近的序列(展示了正义链)，WT-U3表示SEQIDNo.3对应的野生型BADH2基因的位点附近的序列(展示了正义链)，E1-1，E2-1，E2-2，E3-1，E3-2，E4-3和E7-1为测序时不同样品的编号并以此代表不同的突变类型。图2：为图1中展示序列所对应的测序峰图，为对突变体中靶序列测序所获得，(+)表示测序时测到的是靶序列的正义链，(-)表示测序时测到的是靶序列的负义链，中括号内数字范围表示测序峰图中此数字范围内的碱基对应于图1中的对应序列。图3：野生型和突变体中的香味物质2-AP含量，采集时间5.5min处为2-AP峰。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施例做详细说明。一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法，其包括如下步骤：(1)设计基于BADH2基因的sgRNA序列利用在线公开软件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)设计sgRNA引导序列，选择分值较高且位于BADH2基因序列合适位置的引导序列，本实施例所选的sgRNA引导序列为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的序列。(2)设计并合成sgRNA引物根据在线软件设计的sgRNA原始序列及载体构建要求，对于如SEQIDNo.2所示的sgRNA序列，设计的正反引物为sgU6-F(cttgACTAGAGACGCTTGATTGT)和sgU6-R(aaacACAATCAAGCGTCTCTAGT)；对于如SEQIDNo.3所示的sgRNA序列，设计的正反引物为sgU3-F(ggcaAGAGCCTATCGGTGTAGTT)和sgU3-R(aaacAACTACACCGATAGGCTCT)。将设计好的引物交由金斯瑞生物科技有限公司合成。(3)引物退火成双链将合成的正反引物分别用1倍TE缓冲液溶解成100pmol/μl，各取10μL混合，加入0.4μL5MNaCl，充分混匀，于PCR仪中95℃200s，取消低温保存设置，30min后取出并稀释10倍成5pmol/μl接头。(4)连接CRISPR/Cas9载体利用专利技术人所在实验室构建的以U本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统对普通水稻中的BADH2基因进行定点敲除，所述BADH2基因DNA序列如SEQ ID No.1所示，或为与SEQ ID No.1所示序列存在90％以上序列相似性的序列。
【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统对普通水稻中的BADH2基因进行定点敲除，所述BADH2基因DNA序列如SEQIDNo.1所示，或为与SEQIDNo.1所示序列存在90％以上序列相似性的序列。2.如权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统采用的sgRNA引导序列为SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的任一序列。3.如权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法，其特征在于，所述BADH2基因转化子如SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示序列位点的突变，采用如下引物检测：U3/U6-F：5’-AGCCTTCCAGTCTAAATGACAGTAA-3’U3/U6-R：5’-GCTGCTAGGTACAATTTGTGAGACA-3’4.如权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计基于BADH2基因的sgRNA序列；(2)设计并合成sgRNA引物；(3)引...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐秀英，龙起樟，王会民，黄永兰，芦明，万建林，曹志斌，
申请(专利权)人：江西省超级水稻研究发展中心，
类型：发明
国别省市：江西,36
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