HPPD变体及使用方法技术

在本发明专利技术中，记载了示出对一种或多种属于多种化学类别的HPPD抑制剂除草剂完全耐受的HPPD多肽和包含它们的植物。已经设计了一组突变的HPPD多肽，其对HPPD抑制剂除草剂不具有亲和力或仅具有显著降低的亲和力，同时所述突变的HPPD多肽的HPPD抑制剂的解离率被增大到这样的程度：即HPPD抑制剂不再作为缓慢结合或缓慢紧密结合的抑制剂而是已成为完全可逆的抑制剂。具体地，提供了编码突变的HPPD多肽的分离的多聚核苷酸，所述HPPD多肽赋予对属于多种化学类别的HPPD抑制剂除草剂的耐受性。此外，包括对应于所述多聚核苷酸的氨基酸序列。

Variants of HPPD and its usage

In the present invention, HPPD polypeptides showing complete tolerance to one or more herbicides of HPPD inhibitors belonging to a variety of chemical categories and plants containing them are recorded. A set of mutant HPPD polypeptides has been designed, which have no or only significantly reduced affinity to herbicides of HPPD inhibitors. Meanwhile, the dissociation rate of HPPD inhibitors of the mutant HPPD polypeptides has been increased to the extent that HPPD inhibitors are no longer slowly or slowly tightly binding inhibitors but have already been used. Become a completely reversible inhibitor. Specifically, isolated polynucleotides encoding mutant HPPD polypeptides are provided, which confer tolerance to herbicides belonging to a variety of chemical categories of HPPD inhibitors. In addition, an amino acid sequence corresponding to the polynucleotide is included.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】HPPD变体及使用方法
本专利技术涉及植物分子生物学，特别是赋予对HPPD抑制剂除草剂的改进的耐受性的新型HPPD多肽。
技术介绍
4-羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)是催化其中对羟苯丙酮酸(在本文中缩写为HPP)——一种酪氨酸降解产物——被转化为尿黑酸(在本文中缩写为HGA)——生育酚和质体醌在植物中的前体——的反应的酶(CrouchN.P.etal.(1997),Tetrahedron,53,20,6993-7010,Fritzeetal.(2004),PlantPhysiology134:1388-1400)。生育酚作为膜相关抗氧化剂发挥作用。质体醌首先作为PSII和细胞色素b6/f复合体之间的电子载体发挥作用，其次，其是参与类胡萝卜素合成的八氢番茄红素去饱和酶的氧化还原辅因子。迄今为止，存在于NCBI数据库中的来自多种生物的超过1000种核酸序列被注释为编码具有HPPD结构域的推定蛋白。但是对于它们中的大多数，尚未在体外测定法中或在植物学方法中证明所述蛋白具有HPPD酶活性，也未证明当这类HPPD蛋白在植物中表达时能够赋予对HPPD抑制剂除草剂的除草剂耐受性。现有技术中已记载了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组核酸分子，其编码4‑羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)多肽，所述多肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含：(a)在对应于SEQ ID NO:1的第335位氨基酸的氨基酸位置处的脯氨酸，(b)在对应于SEQ ID NO:1的第336位氨基酸的位置处的组氨酸或天冬氨酸，和(c)在对应于SEQ ID NO:1的第337位氨基酸的位置处的丝氨酸，并且其中所述HPPD多肽耐受一种或多种HPPD抑制剂除草剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.11 EP 15184866.01.一种重组核酸分子，其编码4-羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)多肽，所述多肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含：(a)在对应于SEQIDNO:1的第335位氨基酸的氨基酸位置处的脯氨酸，(b)在对应于SEQIDNO:1的第336位氨基酸的位置处的组氨酸或天冬氨酸，和(c)在对应于SEQIDNO:1的第337位氨基酸的位置处的丝氨酸，并且其中所述HPPD多肽耐受一种或多种HPPD抑制剂除草剂。2.权利要求1的重组核酸分子，其中所述编码的HPPD多肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列还包含：i.在对应于SEQIDNO:1的第204位氨基酸的氨基酸位置处的甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸或亮氨酸；和/或ii.在对应于SEQIDNO:1的第213位氨基酸的氨基酸位置处的赖氨酸或亮氨酸；和/或iii.在对应于SEQIDNO:1的第264位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸；和/或iv.在对应于SEQIDNO:1的第268位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸、甘氨酸或丝氨酸；和/或v.在对应于SEQIDNO:1的第270位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸、亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；和/或vi.在对应于SEQIDNO:1的第310位氨基酸的氨基酸位置处的丝氨酸、组氨酸或赖氨酸；和/或vii.在对应于SEQIDNO:1的第315位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸、甲硫氨酸或组氨酸；和/或viii.在对应于SEQIDNO:1的第330位氨基酸的氨基酸位置处的组氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或甘氨酸；和/或ix.在对应于SEQIDNO:1的第331位氨基酸的氨基酸位置处的脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；和/或x.在对应于SEQIDNO:1的第338位氨基酸的氨基酸位置处的缬氨酸；和/或xi.在对应于SEQIDNO:1的第339位氨基酸的氨基酸位置处的谷氨酸、精氨酸、丙氨酸或苏氨酸；和/或xii.在对应于SEQIDNO:1的第340位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸；和/或xiii.在对应于SEQIDNO:1的第344位氨基酸的氨基酸位置处的谷氨酰胺、脯氨酸或精氨酸；和/或xiv.在对应于SEQIDNO:1的第345位氨基酸的氨基酸位置处的赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸或缬氨酸，并且其中所述HPPD蛋白耐受一种或多种HPPD抑制剂除草剂。3.权利要求1的重组核酸分子，其中所述编码的HPPD蛋白由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列还包含：i.在对应于SEQIDNO:1的第213位氨基酸的氨基酸位置处的亮氨酸或赖氨酸；和/或ii.在对应于SEQIDNO:1的第264位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸或亮氨酸；和/或iii.在对应于SEQIDNO:1的第268位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸、甘氨酸或丝氨酸；和/或iv.在对应于SEQIDNO:1的第270位氨基酸的氨基酸位置处的谷氨酸或丝氨酸；和/或v.在对应于SEQIDNO:1的第315位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸或甲硫氨酸；和/或vi.在对应于SEQIDNO:1的第330位氨基酸的氨基酸位置处的组氨酸；和/或vii.在对应于SEQIDNO:1的第338位氨基酸的氨基酸位置处的缬氨酸；和/或viii.在对应于SEQIDNO:1的第340位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸或缬氨酸；和/或ix.在对应于SEQIDNO:1的第344位氨基酸的氨基酸位置处的谷氨酰胺；和/或x.在对应于SEQIDNO:1的第345位氨基酸的氨基酸位置处的赖氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸，并且其中所述HPPD蛋白耐受一种或多种HPPD抑制剂除草剂。4.权利要求1的重组核酸分子，其中所述编码的HPPD蛋白由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列还包含：i.在对应于SEQIDNO:1的第213位氨基酸的氨基酸位置处的赖氨酸；和/或ii.在对应于SEQIDNO:1的第264位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸或亮氨酸；和/或iii.在对应于SEQIDNO:1的第268位氨基酸的氨基酸位置处的甘氨酸或精氨酸；和/或iv.在对应于SEQIDNO:1的第270位氨基酸的氨基酸位置处的谷氨酸；和/或v.在对应于SEQIDNO:1的第315位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸；和/或vi.在对应于SEQIDNO:1的第330位氨基酸的氨基酸位置处的组氨酸；和/或vii.在对应于SEQIDNO:1的第338位氨基酸的氨基酸位置处的缬氨酸；和/或viii.在对应于SEQIDNO:1的第340位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸或缬氨酸；和/或ix.在对应于SEQIDNO:1的第344位氨基酸的氨基酸位置处的谷氨酰胺；和/或x.在对应于SEQIDNO:1的第345位氨基酸的氨基酸位置处的赖氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸，并且其中所述HPPD蛋白耐受一种或多种HPPD抑制剂除草剂。5.权利要求1、2、3或4的重组核酸分子，其中所述编码的HPPD蛋白包含与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有至少53％的序列同一性的氨基酸序列。6.权利要求1-5中任一项的重组核酸分子，其中其核苷酸序列是已被设计用于在植物中表达的合成序列。7.权利要求1-5中任一项的重组核酸分子，其中其核苷酸序列与启动子可操作地连接，所述启动子能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中表达。8.权利要求1-5中任一项的重组核酸分子，其中所述HPPD抑制剂除草剂选自三酮类、二酮腈类、异噁唑类、羟基吡唑类、N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(1,3,4-噁二唑-2-基)苯甲酰胺、N-(四唑-5-基)芳基甲酰胺或N-(三唑-5-基)芳基甲酰胺、哒嗪酮衍生物、oxoprazine衍生物、N-(三唑-2-基)芳基甲酰胺、三嗪酮、吡唑啉酮。9.权利要求8的重组核酸分子，其中所述HPPD抑制剂除草剂选自双环磺草酮、磺草酮、甲基磺草酮、环磺酮、特呋三酮、氟吡草酮、fenquinotrione、异噁唑草酮、二酮腈、苄草唑、吡草酮、吡唑特、磺酰草吡唑、苯吡唑草酮、tolpyralate、2-甲基-N-(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)-3-(甲基磺酰基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺、2-氯-3-乙氧基-4-(甲基磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯甲酰胺、4-(二氟甲基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)苯甲酰胺、2-氯-3-(甲基硫烷基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺和2-(甲氧基甲基)-3-(甲基亚硫酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺。10.一种宿主细胞，其包含权利要求1、2、3或4的重组核酸分子。11.权利要求10的宿主细胞，其为细菌宿主细胞。12.权利要求10的宿主细胞，其为植物细胞。13.一种转基因植物，其包含权利要求1、2、3或4的重组核酸分子。14.权利要求13的植物，其中所述植物选自玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。15.一种转基因种子，其包含权利要求1、2、3或4的重组核酸分子。16.一种重组多肽，其包含HPPD多肽，其中所述HPPD多肽耐受一种或多种HPPD抑制剂除草剂，并且其中所述HPPD多肽包含(a)在对应于SEQIDNO:1的第335位氨基酸的氨基酸位置处的脯氨酸、(b)在对应于SEQIDNO:1的第336位氨基酸的位置处的组氨酸或天冬氨酸和(c)在对应于SEQIDNO:1的第337位氨基酸的位置处的丝氨酸。17.权利要求16的重组多肽，其中所述HPPD蛋白还包含：i.在对应于SEQIDNO:1的第204位氨基酸的氨基酸位置处的甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸或亮氨酸；和/或ii.在对应于SEQIDNO:1的第213位氨基酸的氨基酸位置处的赖氨酸或亮氨酸；和/或iii.在对应于SEQIDNO:1的第264位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸；和/或iv.在对应于SEQIDNO:1的第268位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸、甘氨酸或丝氨酸；和/或v.在对应于SEQIDNO:1的第270位氨基酸的氨基酸位置处的精氨酸、亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；和/或vi.在对应于SEQIDNO:1的第310位氨基酸的氨基酸位置处的丝氨酸、组氨酸或赖氨酸；和/或vii.在对应于SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·林卡，F·波雷，B·雷伯，G·朗格，J·泰比，W·科科，M·施特雷拉特，E·韦伯，N·帕夫洛夫斯基，S·杰斯科，H·巴尔文罗斯，N·沃布斯特，C·西斯，M·杜巴德，
申请(专利权)人：拜耳作物科学股份公司，拜耳作物科学有限合伙公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE