一组用于膀胱癌检测的基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一组用于膀胱癌检测的基因及应用，包括如下32个基因：CA9基因、CDK1基因、CTSE基因、DMBT1基因、ERBB2基因、HOXA13基因、IGF2基因、CXCR2基因、MAGEA3基因、MDK基因、MMP1基因、MMP12基因、RBP2基因、CCL18基因、SNAI2基因、VEGFA基因、MFAP5基因、SGK2基因、WFDC2基因、POSTN基因、NPFFR2基因、ANXA10基因、CTAG2基因、ZDHHC2基因、KRT20基因、PPP1R14D基因、FGD3基因、AHNAK2基因、SEMA3D基因、ZNF707基因、LOC100652931基因、LINC00565基因。经临床验证，采用本发明专利技术所提供的试剂盒检测膀胱癌，准确率高，结果判读客观；同时，作为一项非侵入性检测，较现有的膀胱镜检查，患者的依从性大大提升，对于膀胱癌的早期发现和术后监测具有重要的临床意义。

A group of genes for detection of bladder cancer and their applications

The invention discloses a set of genes and applications for bladder cancer detection, including the following 32 genes: CA9 gene, CDK1 gene, CTSE gene, DMBT1 gene, ERBB2 gene, HOXA13 gene, IGF2 gene, CXCR2 gene, MAGEA3 gene, MDK gene, MMP1 gene, MMP12 gene, RBP2 gene, CCL18 gene, SNAI2 gene, and VEGF gene. A gene, MFAP5 gene, SGK2 gene, WFDC2 gene, POSTN gene, NPFFR2 gene, ANXA10 gene, CTAG2 gene, ZDHHC2 gene, KRT20 gene, PPP1R14D gene, FGD3 gene, AHNAK2 gene, SEMA3D gene, ZNF707 gene, LOC100652931 gene, LINC00565 gene. Through clinical verification, the kit provided by the invention can detect bladder cancer with high accuracy and objective interpretation. At the same time, as a non-invasive detection, the compliance of patients is greatly improved compared with the existing cystoscopy, and it has important clinical significance for early detection and post-operative monitoring of bladder cancer.

【技术实现步骤摘要】
一组用于膀胱癌检测的基因及其应用
本专利技术涉及癌症检测和分子生物学领域，以及诊断技术在临床上的运用。具体地，本专利技术涉及一组用于膀胱癌检测（包括诊断、预后和监测）的基因及其应用，通过检测尿液脱落细胞中特异性基因的表达，鉴别诊断对象是否患有膀胱癌。此外，本专利技术还涉及一种用于膀胱癌检测的试剂盒。
技术介绍
膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌。中国癌症统计数据显示（ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CaCancerJClin,2016,66(2):115-132.），2015年我国新病例数达到约8.05万人，男性为女性的3.3倍。死亡人数估计超过3.29万人，死亡率超过40%，男性为女性的3.2倍。目前，约80%的膀胱肿瘤是非浸润性的乳头瘤(pTa或pT1)，5年内的存活率大约为90%，10年内的存活率大约为80%(PansadoroV,EmiliozziP,DefidioL,etal.BacillusCalmette-GuerinintheTreatmentofStageT1Grade3TransitionalCellCarcinomaoftheBladder:Long-termResults[J].JUrol,1995,154(6):2054-2058.)。而剩余部分在诊断期间发现肿瘤肌层浸润的患者往往预后不佳。因此早期诊断可以显著改善患者生存时间和生存质量。尽管肌肉浸润性疾病需要根治性手术，非肌肉浸润性肿瘤在有或没有膀胱灌注疗法的情况下，通过经尿道切除肿瘤可以更保守地治疗；然而，70%以上的患有早期阶段疾病的患者会在诊断后的前两年复发，这使得膀胱癌成为最常见的癌症之一。如果不及时治疗，这些最初非浸润性病变可演变为肌肉浸润性病变(MillánrodríguezF,ChéchiletonioloG,SalvadorbayarriJ,etal.Primarysuperficialbladdercancerriskgroupsaccordingtoprogression,mortalityandrecurrence.[J].JournalofUrology,2000,164(3):680-684.)。膀胱癌的复发现象意味着患者需要至少每年一次的严格监控。为了生命的质量和积极的临床结果，及时发现疾病复发和早期诊断同样重要。目前的主要检测方法是膀胱镜检查结合尿脱落细胞学检查(VUC)。膀胱镜检查是造成严重不适的侵入性检查，成本高，并且可能造成感染和创伤。这使得部分早期病人对膀胱镜检查存有抵触心理，往往因此贻误病情的诊断和及时治疗。细胞学检查是非侵入性检查膀胱癌的可选择方法。然而，对结果的解读高度依赖于观察者，因此结果较为主观，尤其是在低级肿瘤中。因此，仍需开发用于非侵入性诊断膀胱癌的替代方法，其允许以高灵敏度和特异度客观地诊断膀胱癌。肿瘤是基因组疾病。基因组变化在肿瘤发生和发展中起着重要作用。1999年，美国国立癌症研究所公布的研究项目建议书中首次提出应通过综合的分子分析技术为肿瘤分类提供更多信息，从而使肿瘤分类从传统的形态学转向以分子特征为基础的“分子分型”。近年来，随着分子生物学和生物信息学技术的飞速发展，研究人员采用生物芯片和高通量测序技术，可同时检测肿瘤组织中成千上万个基因的表达水平，从中发现与肿瘤类型相关的基因及特定的表达模式。国内外相关研究报道，基因表达谱分析对从分子水平阐明肿瘤本质及准确划分肿瘤类型可起到重要的辅助作用。例如，Varadhachary和Talantov等筛选出10个组织特异性基因，判别肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌，该方法准确率为78%；Ma等则检测肿瘤组织中92个基因的表达情况，识别32种肿瘤类型，该方法准确率为87%；Rosenfeld等则报道了一项48个microRNAs的检测，识别22种肿瘤类型，准确率为89%。在我国，专利技术人曾于2015年首先公开了一组用于肿瘤分子分型的基因及其应用（专利申请号：201510550924.3），该组基因可以用于区分22种癌症类型，在我国男性和女性最常见十大肿瘤中，96基因模型的分类准确率分别达到95.5%和93.2%。尽管，该组基因对于膀胱癌鉴别诊断具有出色的性能，灵敏度为87.5%和特异度为100%，但其主要应用于石蜡组织标本。国际专利申请WO2014/118334描述了一种基于尿液样品中特定基因的表达模式来进行膀胱癌诊断的体外非侵入性方法。尽管该方法在西方人群的验证研究中体现出较高的灵敏度（78.7%）和特异度（93.2%），但其是否同样适用于中国人群，还需要进一步的实验证实。尿液中仅含有极其微量的肿瘤脱落细胞，如何从微量的肿瘤脱落细胞中提取足量的RNA，从而精确检测膀胱癌相关基因的表达丰度，是当前尿液膀胱癌基因检测的难点。现有的检测方法主要存在以下不足：一、现有方法采用TRIzol溶剂纯化和提取尿液脱落细胞中的RNA，实验过程中需要反复地洗脱、去除上清液，步骤非常繁琐且难以控制，容易造成RNA的损失，最终影响RNA的得率和纯度。例如，国际专利申请WO2014/118334实施例中描述了采用TRIzol（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）抽提法处理尿液标本，结果790名受试者中，有256名(31％)因质量不合格而被排除，有效样本为534名，检测成功率仅为69%。二、为了实现在微量的RNA中，检测到膀胱癌特异基因的表达丰度，要求被检测基因对于膀胱癌具有很高的特异性。当基因组合特异度不够高时，往往需要在逆转录之后，进行一步预扩增的操作，先富集一定量的被检测物，以保证后续定量过程的实施。预扩增完成后，需在实验过程中打开PCR反应试管，重新加入靶基因的特异性探针引物。这一开盖过程极有可能引起PCR产物气溶胶的扩散，进而导致实验室的污染。在处理样本量大，检测任务繁重的临床实验室，预扩增技术的应用存在较大的风险和挑战。三、现有检测方法的实验流程包括：尿液样本预处理和RNA提取（3小时）、逆转录(2.5小时)、预扩增(2小时)、扩增(2小时)和检测分析（0.5小时）。整个实验保守估计耗时超过10小时。在临床实践中，需要两个工作日才能完成1例样本的检测，临床应用面临巨大挑战。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一组用于膀胱癌检测的基因，建立膀胱癌统计分析模型，帮助患者实现个体化治疗，其具有特异性好、检测成功率高、操作简单快速的优势，能够较好地满足临床对于非侵入性检查膀胱癌的迫切需求。本专利技术要解决的技术问题之二是提供一组用于膀胱癌检测的基因的用途。本专利技术要解决的技术问题之三是提供一种用于膀胱癌检测的试剂盒及其用途。本专利技术要解决的技术问题之四是提供一组用于膀胱癌检测的基因在制备用于诊断、预后或监测膀胱癌的基因芯片中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：在本专利技术的一方面，提供一组用于膀胱癌检测的基因，包括如下32个基因：CA9基因、CDK1基因、CTSE基因、DMBT1基因、ERBB2基因、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组用于膀胱癌检测的基因，其特征在于，包括如下32个基因：CA9基因、CDK1基因、CTSE基因、DMBT1基因、ERBB2基因、HOXA13基因、IGF2基因、CXCR2基因、MAGEA3基因、MDK基因、MMP1基因、MMP12基因、RBP2基因、CCL18基因、SNAI2基因、VEGFA基因、MFAP5基因、SGK2基因、WFDC2基因、POSTN基因、NPFFR2基因、ANXA10基因、CTAG2基因、ZDHHC2基因、KRT20基因、PPP1R14D基因、FGD3基因、AHNAK2基因、SEMA3D基因、ZNF707基因、LOC100652931基因、LINC00565基因。

【技术特征摘要】
1.一组用于膀胱癌检测的基因，其特征在于，包括如下32个基因：CA9基因、CDK1基因、CTSE基因、DMBT1基因、ERBB2基因、HOXA13基因、IGF2基因、CXCR2基因、MAGEA3基因、MDK基因、MMP1基因、MMP12基因、RBP2基因、CCL18基因、SNAI2基因、VEGFA基因、MFAP5基因、SGK2基因、WFDC2基因、POSTN基因、NPFFR2基因、ANXA10基因、CTAG2基因、ZDHHC2基因、KRT20基因、PPP1R14D基因、FGD3基因、AHNAK2基因、SEMA3D基因、ZNF707基因、LOC100652931基因、LINC00565基因。2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述膀胱癌检测结果为膀胱癌阳性、或膀胱癌阴性；所述膀胱癌检测的样本为尿液样本。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述尿液样本的预处理方法包括如下步骤：首先离心尿液中脱落的细胞，随后采用纯化柱抽提法以纯化柱作为液体洗脱的介质提取总RNA。4.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因采用如下方法筛选得到：采用“大数据和算法驱动”的分析技术，选取对于膀胱癌高特异性的基因组合；首先构建膀胱癌基因表达谱数据库，包含人类已知2万多个基因、92例样品，超过200万个数据点，将每个样本中人类2万多个基因的表达量数据与样本的临床数据关联起来；然后通过统计分析方法T检验来筛选膀胱癌特异基因，即分析每个基因与膀胱癌的相关性，并将关联度最高的基因提取出来作为特征基因，筛选得到32个基因用于构建分类模型；采用支持向量机算法，建立统计分析模型用于检测膀胱癌，对于每一例待测样本，模型计算该样品基因表达模式与数据库中膀胱癌的相似度分数，并根据相似度分数最大原则判别该样本的是否为膀胱癌。5.如权利要求1-4任一项所述的一组用于膀胱癌检测的基因在制备用于膀胱癌检测的试剂盒中的应用。6.一种用于膀胱癌检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下生物标志物，所述生物标志物选自权利要求1-4任一项所述的一组用于膀胱癌诊断的基因中的任意一种或多种。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述生物标志物是核酸、寡核酸链或PCR引物组。8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR引物组包括：CA9基因：正向引物如SEQIDNO.1所示，反向引物如SEQIDNO.2所示；CDK1基因：正向引物如SEQIDNO.3所示，反向引物如SEQIDNO.4所示；CTSE基因：正向引物如SEQIDNO.5所示，反向引物如SEQIDNO.6所示；DMBT1基因：正向引物如SEQIDNO.7所示，反向引物如SEQIDNO.8所示；ERBB2基因：正向引物如SEQIDNO.9所示，反向引物如SEQIDNO.10所示；HOXA13基因：正向引物如SEQIDNO.11所示，反向引物如SEQIDNO.12所示；IGF2基因：正向引物如SEQIDNO.13所示，反向引物如SEQIDNO.14所示；CXCR2基因：正向引物如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐清华，王奇峰，陈成书，陈金影，孙益丰，任婉丽，王宏莹，吴益旺，霍涛，
申请(专利权)人：杭州可帮基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33