罗非鱼脑细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种罗非鱼脑细胞系的构建方法，其步骤是：取鲜活罗非鱼消毒取脑组织，剪碎块，用胶原酶处理后，加入胰蛋白酶；用含培养液充分悬浮，进行原代培养；细胞长满瓶底时，用胰酶‑EDTA消化，接种传代培养；传代培养60代后，于对数生长期加入秋水仙素处理并进行核型分析。本发明专利技术公开的罗非鱼脑细胞系的制备方法，方法简单方便；并且用该方法制备的罗非鱼脑细胞系，可以进行长时间的传代培养，对罗非鱼出血病病毒非常敏感，可以广泛应用于实验中。

Brain Cell Line of Tilapia and Its Application

The invention discloses a method for constructing a brain cell line of tilapia, which comprises the following steps: taking fresh tilapia, sterilizing brain tissue, cutting fragments, treating with collagenase, adding trypsin; suspending fully with culture medium to carry out primary culture; digesting cells with trypsin and EDTA when they are full of bottle bottom, inoculating and subculturing them; After 60 generations, colchicine was added to the logarithmic growth phase and karyotype analysis was carried out. The preparation method of the tilapia brain cell line disclosed by the invention is simple and convenient, and the tilapia brain cell line prepared by the method can be subcultured for a long time, is very sensitive to the tilapia hemorrhagic disease virus, and can be widely used in experiments.

【技术实现步骤摘要】
罗非鱼脑细胞系及其应用
本专利技术涉及生物细胞学领域，特别涉及一种罗非鱼脑细胞系及其应用。
技术介绍
罗非鱼是世界第二大水产养殖品种，具有杂食性，对高密度养殖方式也具有超强耐受性。这种价格低廉、品质优良的鱼类已成为发展中国家人们重要的食物来源。联合国粮食及农业组织(FAO)数据显示，2015年，全球罗非鱼养殖和捕捞产量达到640万吨，价值约98亿美元，全球贸易额达到18亿美元。目前，中国、印尼和埃及是罗非鱼的三大主要生产国。其中，中国是罗非鱼的养殖大国，养殖产量约占世界总产量的50％，主要集中在广东、广西、海南和福建等地。与其他鱼类比较，罗非鱼曾经以易养殖和抗病力强著称。然而，从2009年开始，以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国等国家先后暴发了罗非鱼湖病毒(TilapiaLakeVirus，TiLV)感染引起的传染病，导致大批野生和养殖罗非鱼死亡，造成严重的经济损失。罗非鱼湖病毒病又称为罗非鱼合胞体肝炎(syncyticalhepatitisoftilapia，SHT)，病原TiLV为近年来新发现的病毒，其分类地位尚未被确认。根据其生物学特性，目前TiLV被归类为正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的一种新的病毒。电子显微镜显示病毒粒子为具包膜的二十面体结构，大小为55～75nm。TiLV是近年来出现的急性传染性病原。国外已经在病毒的细胞培养、组织病理学、PCR、原位杂交等检测技术方面进行了研究，并建立了相应的检测方法。世界卫生组织(OIE)推荐检测水产动物病毒的“黄金标准”是通过细胞来分离病毒。2014年，MarinaEyngo等将发生病变的病鱼器官匀浆，经0.22μm滤膜过滤后，分别与8种不同的细胞系(罗非鱼原代脑细胞、E-11、CHSE-214、BF-2、BB、EPC、KF-1、RTG-2和FHM)进行共孵育，发现该病毒能引起罗非鱼原代脑细胞和E-11细胞系(乌鳢成纤维细胞系)的细胞病变效应(CPE)，分别在共孵育后10-12d、5-7d后出现明显的CPE现象。前者表现为细胞由细长变肿胀、变圆，有颗粒形成，后者表现为胞浆空泡、蚀斑形成。Tsofack研究表明，TiLV可以在E-11、罗非鱼脑细胞原代细胞、OmB和TmB等细胞系进行培养，其中E-11细胞被认为是最合适的细胞系。OmB和TmB细胞对TiLV的感染滴度低于E-11，敏感性也不如E-11。然而，E-11细胞是来源于乌鳢的成纤维细胞，非罗非鱼的本源细胞，长期使用该细胞进行TiLV的增殖，易使病毒致弱，不利于TiLV的纯化及疫苗的研发工作。源于罗非鱼的细胞更有利于TiLV的纯化增殖及疫苗的研发。国内针对TiLV的研究几乎是空白。很多罗非鱼疫病的病因未能彻底调查，无法明确TiLV在我国的感染情况，其中很大一个阻碍因素就是国内目前没有源于罗非鱼的对罗湖病毒的敏感细胞系，无法进行病毒的扩增纯化，无法为罗湖病毒的分离鉴定、诊断及疫苗的研发提供物质基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开一种罗非鱼脑细胞系的制备方法及其应用。本专利技术所采取的技术方案是：一种罗非鱼脑细胞系的构建方法，其步骤是：取鲜活罗非鱼消毒取脑组织，剪碎块，用胶原酶处理后，加入胰蛋白酶；用含培养液充分悬浮，进行原代培养；细胞长满瓶底时，用胰酶-EDTA消化，接种传代培养；传代培养60代后，于对数生长期加入秋水仙素处理并进行核型分析。优选的，培养液为含有20％胎牛血清、20ng/L碱性成纤维样生长因子、1ng/mL的表皮生长因子、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B，PH值为7.2-7.4的M199培养液。优选的，胶原酶处理的方法是：用Ⅰ型胶原酶，37℃下消化30分钟。优选的，加入的胰蛋白酶浓度为0.25％。优选的，原代培养的方法是：用细胞培养液悬浮细胞，于27℃培养；脑细胞迁出后，每隔3～5天换液一次，去除未贴壁的组织和死细胞。优选的，原代培养的方法是：当细胞长满培养瓶底时，用吸管除去旧培养液，PBS洗两次，用0.25％胰酶-EDTA将细胞消化至细胞变圆时，吸弃胰酶，加入新鲜培养液终止消化；用吸管轻吹后收集悬浮细胞，以1：2或1：3的比率接种于培养瓶内，加入培养液，放入27℃培养箱中进行传代培养。优选的呢，秋水仙素处理的方法是：于对数生长期加入终浓度为20μg/mL的秋水仙素，27℃处理4h后收集细胞。一种罗非鱼脑细胞系，其名称为罗非鱼脑细胞TiBC，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCNO:C201829。上述罗非鱼脑细胞TiBC在培养罗非鱼湖病毒病中的应用。本专利技术罗非鱼脑细胞TiBC于2018年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏中心于2018年1月12日收到申请人提供的细胞。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCCNO:C201829，提议的分类学名称为罗非鱼脑细胞TiBC，已于2018年1月18日鉴定保藏的细胞是存活的。本专利技术的有益效果是：首次公开了罗非鱼脑细胞系的制备方法，该制备方法简单方便。并且用该方法制备的罗非鱼脑细胞系(罗非鱼脑细胞TiBC)，可以进行长时间的传代培养，对罗非鱼出血病病毒非常敏感，可以广泛应用于实验中。附图说明图1是罗非鱼脑细胞形态观察。图2是罗非鱼脑细胞最佳培养条件的确定。图3是感染TILV病毒的罗非鱼脑细胞图。图4是第5代和第60代罗非鱼脑细胞染色体分析图。图5是第5代细胞DNA直方图。图6是TiLV接种罗非鱼脑细胞的TCID50测定。具体实施方式实施例1一种罗非鱼脑细胞系的构建方法将上述本专利技术的方法按照细致步骤进行详述如下：1.罗非鱼脑组织的制备：鲜活罗非鱼于75％酒精中浸泡1～2min，置于超净台中无菌取下脑组织，用PBS漂洗2遍后，置于5ml的无菌青霉素小瓶中(含5％胎牛血清的M199培养液)，用手术剪将其剪成约1mm3碎块，加入5mlPBS收集至15ml离心管，1000rpm离心3分钟，离心收集组织块后弃去上清，重复一次。加入组织块约5倍体积的Ⅰ型胶原酶，37℃下消化30分钟，去掉消化液，PBS洗两次，再加入0.25％胰蛋白酶，室温消化6-7min，加入培养液终止消化，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，加入5ml细胞培养液冲洗纱网再过滤一次，将滤过液收集至15ml离心管中，离心去上清，收集细胞。纱网上的组织块可以再重复消化，过滤。用含20％FBS的M199培养液充分悬浮细胞，均匀接种于25cm2的培养瓶中，培养条件为27℃。2.罗非鱼脑细胞培养液的配制：完全培养基配方为所述的培养基配方为含有20％胎牛血清、20ng/L碱性成纤维样生长因子(bFGF)、1ng/mL的表皮生长因子(EGF)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B，PH值为7.2-7.4的M199培养液。3.罗非鱼脑细胞原代培养的启动：用细胞培养液悬浮细胞，于27℃培养；脑细胞迁出后，每隔3～5天换液一次，以去除未贴壁的组织和死细胞；细胞在完全培养液中生长状态良好，增殖明显。4.罗非鱼脑细胞的传代培养：当细胞长满培养瓶底时，用吸管除去旧培养液，PBS洗两次，用0.25％胰酶-EDTA将细胞消化至细胞变圆时，吸弃胰酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种罗非鱼脑细胞系的构建方法，其步骤是：取鲜活罗非鱼消毒取脑组织，剪碎块，用胶原酶处理后，加入胰蛋白酶；用含培养液充分悬浮，进行原代培养；细胞长满瓶底时，用胰酶‑EDTA消化，接种传代培养；传代培养至少58代后，于对数生长期加入秋水仙素处理并进行核型分析。

【技术特征摘要】
2018.05.11 CN 20181045108001.一种罗非鱼脑细胞系的构建方法，其步骤是：取鲜活罗非鱼消毒取脑组织，剪碎块，用胶原酶处理后，加入胰蛋白酶；用含培养液充分悬浮，进行原代培养；细胞长满瓶底时，用胰酶-EDTA消化，接种传代培养；传代培养至少58代后，于对数生长期加入秋水仙素处理并进行核型分析。2.根据权利要求1所述的罗非鱼脑细胞系的构建方法，其特征在于，所述培养液为含有18～22％胎牛血清、18～22ng/L碱性成纤维样生长因子、0.8～1.2ng/mL的表皮生长因子、95～105U/mL青霉素、95～105μg/mL链霉素、0.2～0.3μg/mL两性霉素B，pH值为7.2-7.4的M199培养液。3.根据权利要求1所述的罗非鱼脑细胞系的构建方法，其特征在于，胶原酶处理的方法是：用Ⅰ型胶原酶，35～38℃下消化25～35分钟。4.根据权利要求1所述的罗非鱼脑细胞系的构建方法，其特征在于，加入的胰蛋白酶浓度为0.2～0.3％。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王英英，曾伟伟，王庆，任燕，李莹莹，石存斌，朱新平，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44