本发明专利技术公开了一种甜瓜的SSR分子标记体系及其应用，涉及分子标记技术领域。本发明专利技术用于鉴定甜瓜品种的引物对名称分别为C30、MU5499、MU5554‑1、SSR12083及SSR04219。本发明专利技术研究的上述SSR分子标记引物对多态性高、条带清晰、重复性稳定，可用于构建甜瓜DNA指纹图谱和鉴定甜瓜品种。尤其鉴定西州密1号、西州密3号、西州密25号、西州密17号、西州密21号或西州密29，其效果更明显。
【技术实现步骤摘要】
一种甜瓜的SSR分子标记体系及其应用
本专利技术涉及分子标记
，尤其涉及一种甜瓜的SSR分子标记体系及其应用。
技术介绍
SSR(SimpleSequenceRepeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制等研究中。采用SSR分子标记鉴定甜瓜的技术已有研究，但更需要研究出多态性高、条带清晰、重复性稳定的SSR分子标记以用于构建甜瓜DNA指纹图谱。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实施例提供了一种甜瓜的SSR分子标记体系及其应用，主要目的是解决用于鉴定甜瓜品种的SSR分子标记种类繁多以致无法快速且准确鉴定出甜瓜品种的问题。为达到上述目的，本专利技术主要提供了如下技术方案：一方面，本专利技术实施例提供了一种甜瓜的SSR分子标记体系；所述分子标记体系包括5个引物对；引物对1名称为C30，核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；引物对2名称为MU5499，核苷酸序列为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；引物对3名称为MU5554-1，核苷酸序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；引物对4名称为SSR12083，核苷酸序列为SEQIDNO.7和SEQIDNO.8；引物对5名称为SSR04219，核苷酸序列为SEQIDNO.9和SEQIDNO.10。作为优选，所述甜瓜的新品种为西州密1号、西州密3号、西州密25号、西州密17号、西州密21号或西州密29。另一方面，本专利技术实施例提供了上述甜瓜SSR分子标记体系在鉴定甜瓜品种中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术通过筛选甜瓜基因组SSR引物，记录其碱基序列信息及退火温度，筛选出多态性高、条带清晰、重复性稳定的SSR分子标记体系，用于构建甜瓜DNA指纹图谱，可快速准确鉴定出甜瓜品种。附图说明图1是本专利技术实施例2提供的引物73扩增后的凝胶电泳图谱；图2是本专利技术实施例2提供的引物47扩增后的凝胶电泳图谱；图3是本专利技术实施例2提供的引物14扩增后的凝胶电泳图谱；图4是本专利技术实施例2提供的引物53扩增后的凝胶电泳图谱；图5是本专利技术实施例2提供的引物5扩增后的凝胶电泳图谱；图6是本专利技术实施例3提供的6个甜瓜品种的SSR指纹图谱；图7A-7F是本专利技术实施例3提供的6个甜瓜品种的指纹图谱QR编码；图8是本专利技术实施例3提供的西州密1号的二维码扫描图。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术为达成预定专利技术目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本专利技术申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。实施例1(采用CTAB法提取甜瓜DNA)a.取0.2～0.5g幼叶，置研钵中，加充足液氮研磨，直至成粉末状；b.迅速将粉末转入2ml离心管中；管中已加入760μlCTAB提取缓冲液100mmol/LTris(pH8.0)、1.4mol/LNaCl、50mmol/LEDTA、2％CTAB、2％PVP、20μlβ-巯基乙醇充分混匀；c.65℃水浴30min，水浴过程中将管盖开闭并晃动2～3次；d.冷却至室温，加等体积的24∶1(V/V)氯仿：异戊醇，约900μl，混匀；e.常温离心，12000rpm，15min；f.取2ml离心管，将上清液(约750μl)转入其中；g.加入与上清液等体积的氯仿：异戊醇(V/V为24:1)，倒转离心管数次，混匀；h.常温离心，12000rpm，15min；i.重复f～h步骤1～2次，直到有机相与水相交界处白色杂质消失为止；j.取2ml或5ml离心管，将上清液(约650μl)转入其中；加入预冷过的2×上清液体积的无水乙醇或等体积异丙醇，轻轻旋转试管，然后静置沉淀DNA，管内有絮状DNA出现；k.取1.5ml离心管，加入1ml70％乙醇，将DNA挑入其中，轻轻晃动洗涤，倒掉70％乙醇，加入1ml无水乙醇洗涤一次，倒掉无水乙醇，用枪头吸干无水乙醇。放置在超净工作台上，风机打开10～15分钟至乙醇挥发干净；l.加入500μlTE[10mmol/LTris·HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)]溶解DNA；m.待DNA完全溶解后，加入1μl10mg/mLRNA酶(终浓度约为20μg/mL)。37℃温育30～60min；n.可再次加入等体积的氯仿：异戊醇(V/V为24:1)，倒转离心管数次，混匀，常温离心，12000rpm，10min，取1.5ml离心管，将上清液转入其中；o.加入2×体积预冷的无水乙醇，1/10体积3mol/LNaAc(pH5.2)，-20℃放置1～2hr或过夜，沉淀DNA；p.取0.5ml离心管，用0.5ml70％乙醇和无水乙醇，洗涤DNA各一次，用枪头吸干无乙醇。在超净工作台上充分干燥；q.加入50～100μlTE[10mmol/LTris·HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)]溶解DNA；r.将DNA样分装，一部分供近期使用，一部分长期保存，均置于-20℃保存。将同一种甜瓜的不同10个单株，(如西州密1号、西州密3号、西州密25号、西州密17号、西州密21号或西州密29的10个栽培单株)幼嫩叶片混合,建立基因池，采用上述CTAB法提取各自的基因组DNA；利用琼脂糖电泳法检验DNA片段的完整性和浓度；利用紫外分光光度计上测OD230、OD260、OD280，计算OD260/OD230和OD260/OD280，检测DNA纯度；若OD260/OD280比值在1.60-1.90之间，OD260/OD230大于2.0可用于PCR扩增，否则需要进一步纯化。实施例2(PCR扩增)以实施例1提取的甜瓜DNA(如西州密1号、西州密3号、西州密25号、西州密17号、西州密21号或西州密29)为扩增模板，分别利用引物73(C30)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种甜瓜的SSR分子标记体系，其特征在于，所述分子标记体系包括5个引物对；引物对1名称为C30，核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；引物对2名称为MU5499，核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；引物对3名称为MU5554‑1，核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；引物对4名称为SSR12083，核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；引物对5名称为SSR04219，核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
【技术特征摘要】
1.一种甜瓜的SSR分子标记体系，其特征在于，所述分子标记体系包括5个引物对；引物对1名称为C30，核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；引物对2名称为MU5499，核苷酸序列为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；引物对3名称为MU5554-1，核苷酸序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；引物对4名称为SSR12083，核苷酸序列为...
【专利技术属性】
技术研发人员：李超，孙玉萍，廖新福，杨英，陈伟，郑贺云，杨军，张翠环，杨咪，
申请(专利权)人：新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所，
类型：发明
国别省市：新疆,65
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