利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法。本发明专利技术方法包括：发酵培养灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816，从发酵产物中获得灰黄霉素；所述灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2018187。利用本发明专利技术所提供的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816生产灰黄霉素，采用不用乳糖和玉米浆的原料路线和流加补氯发酵新工艺，可大幅度提高灰黄霉素的发酵效价，降低生产成本，为开发作为抗真菌生物农药——松刚霉素提供可靠的原料来源。

【技术实现步骤摘要】
利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法
本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法。
技术介绍
灰黄霉素作为一类医农两用的抗生素，最早为国外厂商开发的第一代抗皮肤真菌病药物，在20世纪60年代上市，曾被国际药学界誉为是对付真菌病的一大里程碑重大药物。随着生物技术及生物信息学的不断进步，灰黄霉素的应用范围也不断扩大，其中最为让人瞩目方面在抗癌药和农业的应用开发方面，其为灰黄霉素的市场拓展开辟了新途径。经过几十年的长足发展，我国现已成为灰黄霉素原料药的唯一生产国，总产能已扩大至1000吨左右。灰黄霉素农用化使其作为生物农药成为可能，利用生物藕合技术，对灰黄霉素基团进行藕合修饰，使其具备更好的抗植物真菌病原的能力和水溶性，研制出新型抗真菌生物农药——松刚霉素，为进一步开拓灰黄霉素市场提供了广阔的空间。目前国内采用液体深层发酵模式生产的灰黄霉素，其工业化大生产的发酵水平多年来都维持在25000μg/mL左右，糖素的转化率较低，而且在发酵周期超过240h，发酵过程中存在一段明显的停滞期，发酵效率来说还是偏低，致使发酵成本处于高位，农业推广应用受到限制。如何进一步获得高产灰黄霉素的菌株及开发高效的灰黄霉素发酵工艺，对于灰黄霉素的应用及以灰黄霉素为主效成分的生物农药——松刚霉素的开发具有重大意义。
技术实现思路
为了有效解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法。第一方面，本专利技术要求保护一种生产灰黄霉素的方法。本专利技术所提供的生产灰黄霉素的方法，可包括如下步骤：发酵培养灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816，从发酵产物中获得灰黄霉素；所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2018187。该菌株为自行从土壤中分离获得的产灰黄霉素的出发菌株F3215(CCTCCNO：M2018188)通过紫外线加氯化锂诱变获得的优良变株。该优良菌株能够高效积累灰黄霉素，而且发酵周期较现有发酵菌种明显缩短，发酵原料来源广泛，而且无氯灰黄霉素组分含量少。进一步地，对所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816进行发酵培养采用的发酵培养基中的碳源为大米粉。对所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816进行发酵培养采用的发酵培养基中的无有机氮源。对所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816进行发酵培养采用的发酵培养基中的氯化物浓度为15-22g/L(如18g/L)。其中，所述氯化物为氯化钠和氯化钾的总和。更进一步地，所述发酵培养基的组成具体可为如下：每100mL所述发酵培养基中含有大米粉15.0g，KH2PO40.6g，FeSO4.7H2O0.1g，KCl0.8g，NaCl1.0g，(NH4)2SO40.5g，CaCO30.3g，MgSO40.1g，余量为水；pH6.0-6.5。在所述方法中，对所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816进行发酵培养的方法可包括如下步骤：(a)采用种子培养基培养所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816，得到种子液；(b)将(a)所得的种子液转接到所述发酵培养基中进行培养。进一步地，步骤(a)中，采用所述种子培养基培养所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816的方法可包括如下步骤：(a1)制备所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816的大米孢子；(a2)将步骤(a1)制备的大米孢子(孢子浓度达到109个/克培养物)接种到所述种子培养基中进行培养，接种量为每100mL所述种子培养基中接种1.8×106个大米孢子。更进一步地，步骤(a2)中，将所述大米孢子接种到所述种子培养基中进行培养时的条件具体可为：初始搅拌转速220rpm，初始pH6.0，通气量12L/min，培养温度31℃±1℃，溶氧控制在30-50％(溶解于水中的分子态氧称为溶氧，通常记作DO，如30％溶氧表示为100mL溶剂中氧的量为30mg，主要通过溶氧电极检测)，并通过调整搅拌控制溶氧，罐压0.1Mpa，种子培养期间不需要一级摇瓶种子，直接将大米孢子悬液接入种子罐，种子罐周期48h。更进一步地，所述种子培养基的组成如下：每100mL所述种子培养基中含有大米粉5.0g，NaNO30.1g，NaCl0.2g，FeSO4.7H2O0.1g，KH2PO40.4g，KCl0.1g，(NH4)2SO40.5g，CaCO30.18g，余量为水；pH6.0-6.5(如pH6.0)。进一步地，步骤(b)中，将所述种子液转接到所述发酵培养基中可为将所述种子液按照体积分数为15％的移种量转接到所述发酵培养基中。进一步地，步骤(b)中，将所述种子液转接到所述发酵培养基中进行培养(发酵罐培养)的过程中可包括如下步骤：发酵72h开始补充液化大米粉(摇瓶发酵无需补料)，每24h补充添加一次，每次补充至发酵体系总糖浓度30-50g/L。更进一步地，步骤(b)中，将所述种子液转接到所述发酵培养基中进行培养时的条件具体可为：初始搅拌转速180rpm；通气量20L/min；罐压0.1Mpa；培养温度在第0-24小时控制为31±1℃，24小时以后控制为29±1℃；溶氧控制在25-35％(％含义同前述)，并通过搅拌控制溶氧；初始pH为6.0，发酵全程通过流加20％的氨水或20％的磷酸溶液(％表示体积分数)控制pH在6.0-6.5之间；发酵72h开始补充液化大米粉，每24h补充添加一次，每次补充至发酵体系总糖浓度30-50g/L；另外通过流加补充20％(％表示g/100mL)的氯化钠和15％(％表示g/100mL)的氯化钾灭菌混合溶液维持发酵体系的氯离子浓度含量在0.5％-1.0％(％表示g/100mL)；发酵周期为312-336h。其中，所述液化大米粉是按照包括如下步骤的方法制备的：将大米磨成粉后过滤(60目筛)，然后加水，再加入高温α-淀粉酶，85℃水浴加热45min。第二方面，本专利技术要求保护一种用于生产灰黄霉素的试剂盒。本专利技术所提供的用于生产灰黄霉素的试剂盒，含有如下(A1)或(A2)：(A1)前文所述的灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816和前文所述的发酵培养基；(A2)前文所述的灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816、前文所述的发酵培养基和前文所述的种子培养基。第三方面，前文所述的方法或试剂盒在制备松刚霉素中的应用也属于本专利技术的保护范围。实验证明，利用本专利技术所提供的灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816生产灰黄霉素，采用不用乳糖和玉米浆的原料路线和流加补氯发酵新工艺，可大幅度提高灰黄霉素的发酵效价，降低生产成本，为开发作为抗真菌生物农药——松刚霉素提供可靠的原料来源。经发酵罐培养，本专利技术所提供的灰黄青霉(Penicilliumgriseofu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产灰黄霉素的方法，包括如下步骤：发酵培养灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816，从发酵产物中获得灰黄霉素；所述灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2018187。

【技术特征摘要】
1.一种生产灰黄霉素的方法，包括如下步骤：发酵培养灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816，从发酵产物中获得灰黄霉素；所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2018187。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：对所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816进行发酵培养采用的发酵培养基中的碳源为大米粉；和/或对所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816进行发酵培养采用的发酵培养基中的无有机氮源；和/或对所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816进行发酵培养采用的发酵培养基中的氯化物浓度为15-22g/L。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成如下：每100mL所述发酵培养基中含有大米粉15.0g，KH2PO40.6g，FeSO4·7H2O0.1g，KCl0.8g，NaCl1.0g，(NH4)2SO40.5g，CaCO30.3g，MgSO40.1g，余量为水；pH6.0-6.5。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：对所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816进行发酵培养的方法包括如下步骤：(a)采用种子培养基培养所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816，得到种子液；(b)将(a)所得的种子液转接到发酵培养基中进行培养。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，采用所述种子培养基培养所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816的方法包括如下步骤：(a1)制备所述灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816的大米孢子；(a2)将步骤(a1)制备的大米孢子接种到所述种子培养基中进行培养，接种量为每100mL所述种子培养基中接种1.8×106个大米孢子。6.根据权利要求5所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴松刚，黄建忠，黄钦耿，翁雪清，施碧红，梁玲，蔡玉凤，吴宇峰，
申请(专利权)人：福州工微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35