本发明专利技术公开了一种高产苯丙酮酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过构象动力学工程方法改造奇异变形杆菌来源的氨基酸脱氨酶，改造后的氨基酸脱氨酶基因连接于pET 20b载体，在E.coli BL21(DE3)中表达。发酵罐培养重组菌株，收集湿菌体转化丙氨酸生产苯丙酮酸，当湿菌体添加量30g/L，转化12h苯丙酮酸产量可以达到72.5g/L，苯丙氨酸的摩尔转化率达到96.7％。
【技术实现步骤摘要】
一种高效生产苯丙酮酸的方法
本专利技术涉及一种高产苯丙酮酸的方法，属于生物工程
技术介绍
苯丙酮酸(PPA)是一种双羟基化合物，分子式为C9H8O3，结构式如图1。PPA常用于医药、轻工和化工等领域，可以用于制作复方α酮酸片；PPA是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性药物和食品添加剂的合成中间体；PPA还可以用于制备苯乳酸，苯乳酸可以用于抗菌防腐和风味添加剂。PPA作为一种多功能有机酸，目前主要使用化学合成法生产，通常有α-乙酞氨基肉桂酸水解、乙内酰脲与苯甲醛合成法和氯苄经双羟基化反应三条路线。α-乙酰氨基肉桂酸水解制备苯丙酮酸的方法，其合成路线是甘氨酸先制成乙酰甘氨酸，再和苯甲醛缩合，生成的内酯，水解后得乙酰氨基肉桂酸，酸化得苯丙酮酸，产品得率只有50％，该法工艺成熟，设备简单，但由于在内酯合成苯甲醛和醋酐有一部分发生Perkin反应，产生肉桂酸副产物，苯甲醛部分聚合产生油性杂质造成内酯分离困难，导致该方法生产成本高。乙内酰脲与苯甲醛合成法在含有少量氨基酸的水溶液中，苯甲醛和乙内酰脲缩合成亚苄基乙内酰脲，然后用碱液水解生成的亚苯基乙酰脲而得苯丙酮酸钠，原料易得，价格低廉，但是反应温度在100℃左右，且排放大量工业废水。双羰基化法合成苯丙酮酸一般是以氯苄为原料，在过渡金属络合物催化作用下，以Ca、Mg、Ba等碱土金属的弱碱为中和剂，在弱极性溶剂中与一氧化碳反应而得到，此反应需要在高压条件下进行，设备投资大，反应时间长。化学合成法反应条件要求高，产品的的得率低，且会产生有毒有害物质，因此找到高效绿色的生产方法受到广泛关注。PPA的生物法生产可以采用直接发酵法和酶转化法生产。根据文献报道，鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)和摩氏摩根菌(Morganellamorganli)可以直接发酵生产PPA，其中P.vulgaris通过分批发酵产量可以达到3.0g/L。由于菌体内PPA的路径较长，代谢路径酶活低，直接发酵法PAA产量低，且发酵液中含有大量菌体、蛋白质、无机盐等杂质，PPA的下游分离纯化工艺复杂。酶转化法可以利用苯丙氨酸脱氢酶、氨基酸转移酶和和L-氨基酸脱氨酶转化L-苯丙氨酸生产苯丙酮酸。目前报道产量最高的是在大肠杆菌BL21中异源表达奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)来源的L-氨基酸脱氨酶，使用全细胞转化PPA产量可以达到58.4g/L。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术旨在通过基因工程手段改造氨基酸脱氨酶，提高PPA的生产能力，缩短转化周期，减少湿细胞的添加量可以进一步降低PPA的生产成本。本专利技术提供了一种通过构象动力学工程改造得到高酶活力氨基酸脱氨酶的方法，并应用基因工程菌株全细胞转化生产苯丙酮酸的方法，该方法湿菌体用量少、生产强度大、转化效率高，适用于工业化生产苯丙酮酸。本专利技术的第一个目的是提供一种氨基酸脱氨酶的突变体，所述突变体的氨基酸序列含有如SEQIDNO:4所示。本专利技术的第二个目的是提供编码上述氨基酸脱氨酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。本专利技术的第四个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达本专利技术的氨基酸脱氨酶突变体。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主、pET系列的质粒为载体构建得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建，具体包括如下步骤：以pET20b为载体，将SEQIDNO:2所示基因与载体连接，在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中重组表达SEQIDNO:4所示的氨基酸脱氨酶。本专利技术的第五个目的是提供应用本专利技术的基因工程菌生产氨基酸脱氨酶的方法。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌按照5～10％接种量接种于发酵培养基，通气量1.0～2.0vvm，温度35～37℃，搅拌速率550～600rpm，此时设定溶氧为100％，当培养至OD600在8.0，将温度下降至24～25℃，加入5～10g/L乳糖诱导氨基酸脱氨酶的表达，当OD600达到12.0～14.0时，溶氧突然上升至60％以上，此时开始添加补料培养基，通过溶氧与补料相关联，控制溶氧在30～50％，发酵培养22～24h结束发酵。本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分为：甘油6～10g/L，酵母粉10～15g/L，大豆蛋白胨10～20g/L，K2HPO4·12H2O2.0～3.0g/L，KH2PO48.0～10.0g/L。本专利技术的一种实施方式中，所述补料培养基的成分为：甘油400～600g/L，酵母粉10～15g/L，MgSO4·7H2O6～10g/L。本专利技术的第六个目的是提供应用所述基因工程菌生产苯丙酮酸的方法，所述方法是以L-苯丙氨酸为底物，应用所述基因工程菌转化底物生产L-苯丙酮酸。在本专利技术的一种实施方式中，转化体系使用0.015～0.02mol/LpH7.5Tris-HCl作为缓冲体系，苯丙氨酸添加60～65g/L，湿细胞添加量30～40g/L，转化过程中转化液pH出现下降，通过补加4mol/LNaOH控制pH在7.2～7.5，转化温度30℃，转化12h。在本专利技术的一种实施方式中，用所述基因工程菌的湿细胞进行转化，湿菌体添加量为30g/L。本专利技术还提供所述重组菌在食品、医药、化工领域的应用。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术是使用来源于奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)的氨基酸脱氨酶生产苯丙酮酸，经过构象动力学的方法进行蛋白质工程改造后，该酶催化L-丙氨酸生产苯丙酮酸的产量比野生型产量提高约70％。(2)氨基酸脱氨酶的突变体M5的产物抑制常数KPI从22.8g/L增大到84.4g/L，动力学参数kcat值比野生型增加了2倍，催化效率(kcat/KM)是野生型的1.6倍。(3)该酶经过改造后，转化体系中添加湿细胞添加量30.0g/L，转化12h，转化率达到95％以上，产量达到72.5.0g/L，生产强度显著增加，下游纯化简易，极大的降低了生产成本，能够满足工业化需求。附图说明图1：α-苯丙酮酸结构；图2：18种单点突变体的转化能力评价；图3：不同pH对苯丙酮酸生产的影响；图4：苯丙酮酸转化过程曲线；其中■，L-苯丙酮酸(PLA)的浓度；●，苯丙酮酸(PPA)的浓度；▲，转化率。具体实施方式下述实验都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得。样品预处理：取转化液12000rpm离心10min收集上清液，并以PPA作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法检测。苯丙酮酸含量的测定：高效液相色谱法，流动相成分：稀硫酸(275μL/L)，流速0.6mL/min；进样体积：10μL；色谱柱：AminexHPX-87HIonExclusionColumn，300×7.8mm；检测器：紫外检测器，波长为210nm。氨基酸脱氨酶的酶活检测：将15mL浓度约为30g/L的L-苯丙本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，所述氨基酸脱氨酶的氨基酸序列中含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或者所述氨基酸脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；或者所述氨基酸脱氨酶的氨基酸序列是在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的基础上将第105的氨基酸残基T突变为A，或者将第412位的氨基酸残基S突变为A，或者将第417位的氨基酸残基E突变为A，或者将340位的氨基酸残基E突变为A，或者将145位的氨基酸残基E突变为A。
【技术特征摘要】
1.一种氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，所述氨基酸脱氨酶的氨基酸序列中含有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，或者所述氨基酸脱氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；或者所述氨基酸脱氨酶的氨基酸序列是在SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的基础上将第105的氨基酸残基T突变为A，或者将第412位的氨基酸残基S突变为A，或者将第417位的氨基酸残基E突变为A，或者将340位的氨基酸残基E突变为A，或者将145位的氨基酸残基E突变为A。2.编码权利要求1所述突变体的基因。3.含有权利要求2所述基因的载体。4.一种生产氨基酸脱氨酶重组菌，其特征在于，表达权利要求1所述的突变体。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，是以大肠杆菌为宿主、采用pET系列载体构建得到的。6.一种生产高酶活L-氨基酸脱氨酶的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求1所述的突变体或权利要求4所述的重组菌。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是将表达权利要求1所述突变体或权利要求4所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳，吴静，杨彬，陈修来，罗秋玲，
申请(专利权)人：江南大学，无锡宸明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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