The invention provides a novel high throughput and fast directed evolution method for protein, which greatly improves the library building efficiency. Using this method, two highly active mutant proteins, MomL, a quorum-sensing quenching enzyme from marine sources, were obtained quickly and successfully. Seven unreported active sites were found. The control effects of MomL and MomL on Pcc-induced plant soft rot were investigated. The results showed that MomL and MomL had good control effects on Pcc-induced plant soft rot. Good application prospects.
【技术实现步骤摘要】
一种用于病害防治的高活力蛋白的构建方法与应用
本专利技术属于功能性蛋白筛选
，具体涉及一种用于病害防治的高活力蛋白的构建方法与应用。
技术介绍
高丝氨酸内酯(N-Acylhomoserinelactones,AHLs)作为一种群体感应(QuorumSensing,QS)信号分子，常出现于革兰氏阴性菌中，调控其诸多行为，特别是致病因子的表达、毒素的产生、生物被膜的形成等。群体感应淬灭酶(QuorumQuenchingenzyme,QQ酶)可以阻断QS信号通路，因其不会对致病菌造成生存压力，不易使其产生耐药性，已经受到研究者越来越多的重视。QQ酶有望将其作为一种新型环境友好型生物防治手段，被广泛应用于水产养殖，农作物种植等领域。蛋白分子的定向进化是一种有效改造蛋白质的分子生物学手段，特别是优化新型酶方面。这一过程不需事先了解酶的空间结构和催化机制，而是在实验室里模拟自然界的突变、进化过程，通过易错PCR、辐射诱变等方法，对蛋白进行随机诱变。然后根据不同蛋白的筛选方法，设定合适的高通量筛选方法，筛选出目的菌株，进而得到想要的突变蛋白。定向进化是改进蛋白功能与活性的...
【技术保护点】
1.一种用于病害防治的高活力蛋白的构建方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)首先设计易错PCR引物，并且在易错PCR过程中选择合适的Mg2+和Mn2+浓度，获得易错PCR的产物；2)通过连接液将易错PCR的产物与相应的载体相连接，构建重组表达质粒；3)以CV026为报告菌株，将转化后的菌落转印到IPTG‑CV026筛选平板上，培养后筛选产生透明圈的重组菌株，其中透明圈的大小可间接反应各个突变蛋白的AHL内酯酶活性高低；4)对筛选出的突变蛋白进行测序，获得突变蛋白的序列。
【技术特征摘要】
1.一种用于病害防治的高活力蛋白的构建方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)首先设计易错PCR引物，并且在易错PCR过程中选择合适的Mg2+和Mn2+浓度，获得易错PCR的产物；2)通过连接液将易错PCR的产物与相应的载体相连接，构建重组表达质粒；3)以CV026为报告菌株，将转化后的菌落转印到IPTG-CV026筛选平板上，培养后筛选产生透明圈的重组菌株，其中透明圈的大小可间接反应各个突变蛋白的AHL内酯酶活性高低；4)对筛选出的突变蛋白进行测序，获得突变蛋白的序列。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中用于易错PCR的Mg2+终浓度为2mM，Mn2+终浓度为0.15mM。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的用于病害防治的高活力蛋白为MomL蛋白。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的易错PCR引物，其中上游引物的序列为SEQIDNO:7，下游引物对的序列为SEQIDNO:8。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：王岩，张晓华，林婧，张静静，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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