一种新型木糖苷酶及其基因、工程菌、制备方法和应用技术

本发明专利技术属于酶的基因工程技术领域，涉及一种来源于短小芽孢杆菌的新型木糖苷酶及其基因、工程菌、制备方法和应用。其技术方案是利用分子生物学手段和基因工程技术获得该新型木糖苷酶的基因，然后将该新型木糖苷酶基因，分别在枯草芽孢杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌高稳定性木糖苷酶重组菌株和毕赤酵母高稳定性木糖苷酶游离表达重组菌株，实现新型木糖苷酶的制备，解决现有技术中木糖苷酶在低温条件下活力低的问题，同时该新型细菌木糖苷酶在木聚糖酶的协同作用下彻底分解木聚糖和利用木糖合成木二糖有较好的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种新型木糖苷酶及其基因、工程菌、制备方法和应用
：本专利技术涉及一种来源于短小芽孢杆菌的新型木糖苷酶及其基因、工程菌和制备方法和应用，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该新型木糖苷酶的重组表达菌株，以及该细菌木糖苷酶蛋白与木聚糖酶协同分解木聚糖和利用木糖合成木二糖的应用，属于酶的基因工程

技术介绍
：木糖苷酶(β-D-xylosidexylohydrolase，EC3.2.1.37)是一种外切酶，主要催化水解木糖苷和以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，水解产物为木糖。在自然界中广泛分布，真菌、细菌、放线菌等微生物均可产生，此外大麦等高等植物也可产生木糖苷酶。多数细菌和酵母主要产生胞内木糖苷酶，而一些真菌则能产胞外木糖苷酶。β-木糖苷酶蛋白有单体，二聚体，三聚体等，分子量一般为26-400KDa。β-木糖苷酶分为胞外型、胞内型和膜结合型。纯化后的β-木糖苷酶一般不具有其他酶活性，但也有一些木糖苷酶为双功能酶或多功能酶，例如，一些木糖苷酶具有阿拉伯糖苷酶等活性。目前，β-木糖苷酶已广泛应用于包括食品、药品、造纸、能源等多个领域。木聚糖是来源丰富的自然资源，且工农业生产的废弃物中也存在大量的木聚糖。如将其降解可作为碳源产生多种发酵产物，因此木聚糖酶系被广泛关注。而木糖苷酶是木聚糖彻底降解为木糖的关键酶之一，如酒精等许多发酵产物都必须通过木糖转化产生。因此，木糖苷酶也开始受到重视。在造纸工业中，传统的硫酸盐制浆法会有木质素残留，会影响纸浆质量降低纸张强度。目前去除木质素广泛采用的化学漂白法，使工业废水中含有大量有毒物质，严重污染环境，若减少有毒化学物质使用则会提高处理成本。采用生物漂白剂进行处理，减少了有害化学物质的使用，对经济和环保具有重大意义。β-木糖苷酶单独处理或与木聚糖酶共同处理麦草浆则可以明显提高纸浆质量。同时，β-木糖苷酶具有的转糖基作用能够形成新的糖苷键使寡糖链增长。AspergillusawamoriX-100中的β-木糖苷酶表现出了非常高的转糖基能力，能产生聚合度水平高于七的木寡糖。Talaromycesamestolkiae中的GH3家族β-木糖苷酶BxTW1利用这种特性能够利用转糖基作用合成木二糖和木三糖等化合物。β-木糖苷酶被广泛应用于食品、生物转化和造纸行业等工业，但是在实际应用中面临着一个比较突出的问题：为了减少食品中活性成分、风味物质和营养成分的损失，一些如葡萄酒发酵和果汁澄清等食品加工过程通常需要在低温条件下进行(<30℃)，但当前工业应用的木糖苷酶都属于中高温酶(40-60℃)，它们在低温条件下(0-20℃)的活力很低甚至完全丧失，如果不解决木糖苷酶在低温条件下活力低的问题，将严重限制其在食品加工及其他需要低温处理工业中的应用。枯草芽胞杆菌属于革兰氏阳性菌。枯草芽胞杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效地分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽胞杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽胞杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，枯草芽胞杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。毕赤酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速。毕赤酵母系统用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。毕赤酵母表达系统在表达外源目的蛋白时具有很多优点，具有广阔的前景，适合工业化和规模化生产，该表达系统的优点主要表现在：1、表达量高：毕赤酵母表达系统的表达载体，是以醇氧化酶基因的启动子启动表达的，其外源目的蛋白的表达量很高，P.pastoris的表达量比一般表达系统的表达量(常用表达系统的表达量一般在毫克级)高10倍甚至100倍。2、稳定性高：毕赤酵母表达系统的表达载体通过整合在酵母的染色体上而存在，并且随染色体的复制而复制，不是以质粒自我复制的形式存在，因此重组菌株的稳定性很高。3、高分泌表达：毕赤酵母表达系统的表达载体中a因子前导序列是一个具有很好的分泌效果的分泌信号序列，能够通过一定的途径使表达产物分泌到细胞外，同时减轻了宿主细胞的代谢负荷，有利于细胞的持续生长。4、目的蛋白翻译后的加工和修饰：毕赤酵母具有真核生物完整的亚细胞结构，能够进行真核生物蛋白翻译后的加工修饰过程(如糖基化、脂酞化、磷酸化、蛋白裂解、折叠以及二硫键的形成等)，从而使分泌蛋白的结构更接近于天然蛋白，而且糖基化程度合适，适于临床使用。5、遗传背景研究较清楚，能够通过基因表达调控机制实现目的蛋白的高水平表达。6、易于进行工业化生产，毕赤酵母属于单细胞微生物，具有生产成本低，营养要求简单(酵母的碳源一般为甘油、葡萄糖以及甲醇等)，发酵工艺简单，可进行高密度发酵等优点，酵母具有大规模发酵生产外源蛋白的潜力，而且酵母表达系统自我分泌的杂蛋白很少，对于目的蛋白的纯化有利。毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因较为理想的工具。在本专利技术中，新型木糖苷酶编码基因来源于短小芽孢杆菌，它属于细菌，对短小芽孢杆菌基因组中新型木糖苷酶编码基因进行克隆，新型木糖苷酶基因在枯草芽胞杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌高稳定性木糖苷酶重组菌株和毕赤酵母高稳定性木糖苷酶游离表达重组菌株，重组菌株发酵后，经过相应的处理，可以得到高稳定性木糖苷酶催化剂，该新型重组木糖苷酶不仅可以与木聚糖酶协同作用将木聚糖彻底分解成木糖还可以利用木糖合成木二糖。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于克服和避免目前工业上生产低温木糖苷酶所存在的不足之处，提供一种来源于短小芽孢杆菌的新型细菌木糖苷酶及其编码基因与表达该新型细菌木糖苷酶基因的工程菌株。本专利技术实现上述目的的技术路线如下：以短小芽孢杆菌的基因组为模板，并根据已报道的短小芽孢杆菌木糖苷酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本专利技术的木糖苷酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2、P3和P4，其中，上游引物P1和下游引物P2是用来扩增在枯草芽胞杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoRI、NotI；上游引物P3和下游引物P4是用来扩增在毕赤酵母GS115中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoRI、NotI。通过PCR克隆获得短小芽孢杆菌的木糖苷酶基因Xyl，将其与pBSA43载体和pPIC9K载体分别连接后，构建重组质粒pBSA43-Xyl和pPIC9K-Xyl；转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-Xyl和JM109/pPIC9K-Xyl。再次将验证正确的重组质粒pBSA43-Xyl和pPIC9K-Xyl，分别在枯草芽胞杆菌WB600和毕赤酵母GS115中成功表达，得到产高稳定性新型木糖苷酶的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高稳定性新型木糖苷酶。本专利技术获得木糖苷酶基因Xyl，并引入限制性酶切位点EcoRI、NotI的方法不限于PCR克隆，也可通过包括基因合成在内的方法获得。为了实现上述目的，本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种来源于短小芽孢杆菌的新型细菌木糖苷酶，其特征在于，所述细菌木糖苷酶的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种来源于短小芽孢杆菌的新型细菌木糖苷酶，其特征在于，所述细菌木糖苷酶的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNo.2所示。2.根据权利要求1所述的一种来源于短小芽孢杆菌的新型细菌木糖苷酶，其特征在于，编码所述细菌木糖苷酶的基因为Xyl，其碱基序列如序列表SEQIDNo.1所示。3.根据权利要求1所述的一种来源于短小芽孢杆菌的新型细菌木糖苷酶，其特征在于，所述细菌木糖苷酶的制备方法包括如下步骤：(1)将权利要求2所述的基因进行酶切，与表达载体连接得到重组载体；(2)将重组载体转化入宿主细胞中，得到重组菌株，之后将重组菌株发酵，得到高稳定性细菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘逸寒，路福平，李玉，郑东，徐泽华，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12