本发明专利技术公开了一种源自放线菌的转氨酶、突变体、重组菌及应用本发明专利技术提供的R‑3‑氨基丁醇的生物制备方法，初始原料为丁酮醇，价格便宜。所需的重组转氨酶可通过构建大肠杆菌基因工程菌，然后通过发酵大量制备，相对易得和廉价。所述反应为“一锅煮”式，底物和酶加入后开始反应，直接得到终产物R‑3‑氨基丁醇，工业成本低。本发明专利技术所提供的放线菌转氨酶突变体与野生型相比较，具有更优良的催化活性。在最优体系下，对100mM底物的转化率达90％，ee值达到99.9％；对500mM底物的转化率达到78％，ee值达到99.9％，与野生型相比较，对底物转化率分别提高了12％‑25％。
【技术实现步骤摘要】
一种源自放线菌的转氨酶、突变体、重组菌及应用(一)
本专利技术涉及一种来源于放线菌(Actinobacteria)的转氨酶基因、突变体、工程菌及其在催化合成R-3-氨基丁醇中的应用。(二)
技术介绍
R-3-氨基丁醇结构式如下，在有机合成和药物生产中有着广泛的用途。R-3-氨基丁醇是合成度鲁特韦的重要原料，度鲁特韦是2013年被美国FDA批准上市的抗艾滋病整合酶抑制剂，与现有的HIV整合酶抑制剂雷特格韦、埃替格韦相比，该药物的安全性提高，与默沙东的抗HIV/AIDS药物拉替拉韦相比，度鲁特韦不但在三期临床试验中达到了与其相匹敌的疗效，而且不需要与药物促进剂联合用药，同时具有非常强效的耐药属性。中间体R-3-氨基丁醇品质的好坏以及价格的高低对于度鲁特韦的品质及生产成本有着很重要的影响。另外，R-3-氨基丁醇还能够衍生为β-内酰胺，进而可以合成青霉烯类抗生素。因此，对R-3-氨基丁醇合成的研究具有重要的意义。目前，文献所报导R-3-氨基丁醇的合成方法主要有以下几种：1、由手性R-3-氨基丁酸酯直接酯还原；该方法虽然步骤少，但是手性R-3-氨基丁酸酯很难得到，而且价格昂贵，对映体过量值不高，还原收率较低。2、以手性(R)-丙氨酸为起始原料，经氨基保护后，以重氮甲烷增长碳链变为β-氨基酸酯，脱保护后还原得到目标产物。该方法的缺点是高手性纯度的(R)-丙氨酸较难得到，重氮甲烷使用危险。3、巴豆酸酯与(R)-(+)-α-苯乙胺反应生成具有两个手性中心的一组差向异构体，通过硅胶柱层析分离后得到单一的异构体，然后经过酯还原、脱苄基得到R-3-氨基丁醇；该路线步骤较少，原料易得，但是还存在以下问题：由于第一步反应选择性较差，得到几乎等量的两个差向异构体，分离纯化比较困难，常采用色谱柱法分离，洗脱剂用量大、损失大、效率低；同时由于使用了价格昂贵的LiAlH4作为还原剂，原材料成本也显著上升，由于效率与成本原因，柱层析方法不宜规模化工业化生产。生物催化合成R-3-氨基丁醇具有反应条件温和、效率高、立体和区域选择性强、环境友好等特点，越来越受到关注。此外，利用理性设计和定向进化对生物催化剂进行分子改造，提高催化剂的活性、立体选择性等催化属性，进一步通过反应体系的优化，推动其工业化生产进程具有重要意义。目前尚没有用生物催化合成的报道，而本专利技术所涉及的放线菌(Actinobacteria)来源转氨酶，于大肠杆菌进行表达、改造后，首次运用于R-3-氨基丁醇的合成应用。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种源自放线菌的转氨酶、突变体及催化合成R-3-氨基丁醇的应用，以丁酮醇为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，催化合成R-3-氨基丁醇(图1)；通过定向进化策略对放线菌来源的转氨酶进行改造，获得突变体蛋白，其酶活提高，对R-3-氨基丁醇的合成能力提高。本专利技术采用的技术方案是：第一方面，本专利技术提供一种能催化丁酮醇合成R-3-氨基丁醇的源自放线菌(Actinobacteria)的转氨酶，所述基因序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还涉及转氨酶基因构建的重组载体及基因工程菌。所述转氨酶催化合成R-3-氨基丁醇方法为：以含转氨酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以丁酮醇为底物，以辅酶磷酸吡哆醛为辅因子，以异丙胺或D-丙氨酸为氨基供体，以乙腈或二甲基亚砜为助溶剂，以pH5.0～9.0的缓冲液(优选pH8.0-8.5的Tris-HCl缓冲液)为反应介质构成反应体系，在温度20～45℃(优选30℃)条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得R-3-氨基丁醇；反应体系中，底物终浓度为20-500mM(优选50-100mM)，辅因子终浓度0.1-2mM(优选1mM)，氨基供体终浓度为0.04-3M(优选0.1-2M，更优选0.2-0.4M)，，助溶剂体积浓度0.1％-15％(优选5-10％)，催化剂用量以湿菌体重量计为10-100g/L(优选50-100g/L，最优选50g/L)。第二方面，本专利技术提供一种源自放线菌(Actinobacteria)的转氨酶突变体，所述突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列的第80位、294位进行单突变或双突变获得的。进一步，所述突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列的第80位缬氨酸突变为甘氨酸，同时将第294位苏氨酸突变为丝氨酸获得的，所述突变体氨基酸序列为SEQIDNO.4所示。本专利技术涉及一种所述的转氨酶突变体编码基因，所述编码基因核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。本专利技术针对放线菌(Actinobacteria)来源的转氨酶序列，进行人工设计、合成，成功克隆于大肠杆菌后进行了该基因的表达。进一步从大肠杆菌中提取含转氨酶基因的质粒，使用易错PCR的方法对转氨酶的核苷酸序列进行改变，连接于表达载体后，同样表达于大肠杆菌，通过筛选获得活力提高的突变体，以便能够提高其对于丁酮醇的催化活力。本专利技术可通过本领域常规方法将本专利技术的转氨酶及其突变体的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。本专利技术的重组载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持其复制或自主复制，所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28b。较佳地，可通过下述方法获得本专利技术的重组表达载体：将获得的野生型转氨酶及突变体基因产物与载体pET-28b连接，构建本专利技术的转氨酶突变基因重组表达质粒pET28b-TA0和pET28b-TA1。引入编码本专利技术的转氨酶及其突变体的DNA的宿主细胞没有限制，只要已经为其建立了重组表达系统，满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本专利技术的转氨酶突变基因可以有效表达。例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、曲霉菌，以及动物细胞和高等植物细胞。本专利技术优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。将重组质粒pET28b-TA0和pET28b-TA1转化至E.coliBL21(DE3)中，获得工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-TA0和E.coliBL21(DE3)/pET28b-TA1。本专利技术重组转氨酶及其突变体的制备包括培养本专利技术的重组表达转化体，诱导获得重组转氨酶突变蛋白。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本专利技术的转氨酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生菌体即可。优选下述方法：将本专利技术涉及的重组E.coliBL21(DE3)/pET28b-TA0和E.coliBL21(DE3)/pET28b-TA1接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至光密度OD600达到0.4～1(优选0.4)时，在终浓度为0.1～1.0mM(优选1.0mM)异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本专利技术的转氨酶及其突变蛋白。第三方面，本专利技术利用转氨酶突变体合成R-3-氨基丁醇的方法为：以含转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以丁酮醇为底物，以辅酶磷酸吡哆醛(P本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种源自放线菌的转氨酶，其特征在于所述转氨酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种源自放线菌的转氨酶，其特征在于所述转氨酶氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。2.一种权利要求1所述的转氨酶在合成R-3-氨基丁醇中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述R-3-氨基丁醇合成方法为：以含转氨酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以丁酮醇为底物，以辅酶磷酸吡哆醛为辅因子，以异丙胺或D-丙氨酸为氨基供体，以乙腈或二甲基亚砜为助溶剂，以pH5.0～9.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度20～45℃条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得R-3-氨基丁醇；反应体系中，底物终浓度为20-500mM，辅因子终浓度0.1-2mM，氨基供体终浓度为0.04-3M，助溶剂体积浓度0.1％-15％，催化剂用量以湿菌体重量计为10-100g/L。4.一种权利要求1所述源自放线菌的转氨酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列的第80位、294位进行单突变或双突变获得的。5.如权利要求4所述的转氨酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列的第80位缬氨酸突变为甘氨酸，同时将第294位苏氨酸突变为丝氨酸获得的。6.一种权利要求5所述转氨酶突变体的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。7.一种权利要求6所述的转氨酶突变体编码基因构建的重组基因工程菌。8.一种权利要求4所述的转氨酶突变体在合成R-3-氨基丁醇中的应用。9.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述R-3-氨基丁...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤晓玲，郑裕国，郑仁朝，张南南，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。