一种检测RANKL靶向治疗药物生物学活性的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测RANKL靶向治疗药物生物学活性的方法，其包括以下步骤：步骤一：构建转录因子NF‑kB结合序列，然后将所述NF‑kB结合序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，将所述NF‑kB结合序列作为启动子的组成部分，引导荧光素酶报告基因的转录，得到含有所述NF‑kB结合序列和荧光素酶报告基因的质粒；步骤二：用含有NF‑kB结合序列和荧光素酶报告基因的质粒转染细胞；步骤三：接种细胞，同时加入RANKL和所述RANKL靶向治疗药物，然后培养细胞；步骤四：裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定所述RANKL靶向治疗药物的生物学活性。本发明专利技术的方法能准确、简单易行、快速检测地诺单抗RANKL靶向治疗药物生物学活性。

A method for detecting biological activity of RANKL targeted drug

The invention provides a method for detecting the biological activity of RANKL targeting therapy drugs, which comprises the following steps: step 1: constructing the transcription factor NF kB binding sequence, then cloning the NF kB binding sequence into the luciferase reporter gene vector, and introducing the NF kB binding sequence as a component of the promoter; Transcription of the luciferase reporter gene yields plasmids containing the NF_kB binding sequence and the luciferase reporter gene; step 2: transfection of cells with the plasmid containing the NF_kB binding sequence and the luciferase reporter gene; step 3: inoculation of cells with the addition of the RANKL and the targeted therapeutic drug of the RANKL, and then culture The fourth step is to lyse cells, add luciferase substrates and detect the fluorescence intensity to determine the biological activity of the targeted treatment drug of RANKL. The method of the invention can accurately, simply and rapidly detect the biological activity of the targeted therapy drug of dinozyme monoclonal antibody RANKL.

【技术实现步骤摘要】
一种检测RANKL靶向治疗药物生物学活性的方法
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种检测RANKL靶向治疗药物生物学活性的方法。
技术介绍
治疗骨质疏松和骨癌转移的单克隆抗体狄诺塞麦(Denosumab以下简称地诺单抗，商品名爱必妥，Amgen公司上市产品)是通过阻断RANKL(ReceptorActivatorforNuclearFactor-kBLigand，核因子kB受体活化因子配体)蛋白的生物学活性起作用的。当RNAKL与其受体RANK蛋白结合后通过信号转导作用，激活一系列转录因子和诱导基因转录。这些被诱导转录的基因中，有一部分参与诱导破骨细胞分化成熟的作用和诱导骨癌细胞转移的作用。转录因子NF-kB是已经被证明能被RANKL-RANK通路激活的关键转录因子。其中有众多基因都能被NF-kB激活转录，例如，NF-kB转录因子激活可以诱导RUNX2、酸性磷酸酶和趋化因子等。这些基因的功能在增加破骨细胞活性中起了至关重要的作用。地诺单克隆抗体通过阻断RANKL与RANK蛋白的结合，从而阻断该通路的信号转导信号，抑制转录因子NF-kB的转录作用。因子，地诺单抗能阻断破骨细胞的分化，抑制破骨细胞的骨质重吸收作用，也就起到了治疗骨质疏松的作用。据Amgen公司文献报道，检测地诺单抗的生物学活性是通过检测抑制鼠骨癌细胞RAW264.7细胞系向破骨细胞分化而体现的。该检测方法主要的缺点是：1、耗时，需要诱导长达5天至10天，中间还要对细胞进行换液和添加各药物成分；2、诱导效果不显著，从诱导和诱导抑制的百分率来看，阴性对照和阳性对照之间的差异在100％-300％之间，检测的窗口较小。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种能准确、简单易行、快速检测地诺单抗RANKL靶向治疗药物生物学活性的方法。为此，本专利技术提供了以下技术方案：一种检测RANKL靶向治疗药物生物学活性的方法，其包括以下步骤：步骤一：构建转录因子NF-kB结合序列，然后将所述NF-kB结合序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，将所述NF-kB结合序列作为启动子的组成部分，引导荧光素酶报告基因的转录，得到含有所述NF-kB结合序列和荧光素酶报告基因的质粒；步骤二：用含有NF-kB结合序列和荧光素酶报告基因的质粒转染细胞；步骤三：接种细胞，同时加入RANKL和所述RANKL靶向治疗药物，然后培养细胞；步骤四：裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定所述RANKL靶向治疗药物的生物学活性。如果同时加入RANKL和RANKL靶向治疗药物后测得的荧光强度低于仅加入RANKL后测得的荧光强度，则RANKL靶向治疗药物具备生物学活性。荧光强度(或相对荧光强度)越低，则待检测的RANKL靶向治疗药物的生物学活性越强。荧光强度(或相对荧光强度)越高，则待检测的RANKL靶向治疗药物的生物学活性越弱。本文所称的“RANKL靶向治疗药物”是指以对RANKL具有靶向阻断作用的药物，包括但不限于单克隆抗体、含有单克隆抗体作为活性成分的药物制剂、融合蛋白、反义核苷酸、激酶抑制剂、化合物、中药提取物、中药复方提取物、或其组合。更优选地，所述RANKL靶向治疗药物包括但不限于地诺单抗。优选地，所述荧光素酶报告基因载体包括但不限于pGL2.0、pGL3.0、pGL4.22载体，最优选为pGL4.22载体。优选地，步骤二和步骤三中的细胞可以是表达RANK蛋白的人永生化活细胞，包括但不限于293F细胞。优选地，步骤三中培养细胞的时间为至少24小时，更优选为24小时。优选地，在步骤三中，加入荧光素酶的底物之后，静置至少5分钟后再进行检测。优选地，所述NF-kB结合序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述RANKL的加入量为10ng/ml至100ng/ml。优选地，所述RANKL靶向治疗药物的加入量为10μg/ml。与现有的检测方法相比，本专利技术的方法简单易行，没有繁琐的中间操作过程，可在24小时简便、准确、快速地检测RANKL靶向治疗药物(特别是地诺单抗)的生物学活性，特别适用于生物制品的质量检测和质量控制。附图说明图1是pGL4.22载体的示意图。图2是转染含NF-kB结合序列荧光素酶报告基因的质粒pGL4.22-NF-kB后，形成稳定克隆后的单克隆细胞株293F-NF-kB的测序结果。图3是293F-NF-kB细胞在非特异性IgG、TNFa和RANKL刺激后荧光素酶转录和萤光强度的检测信号。图4是检测地诺单抗对RANKL蛋白的阻断效果。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不对本专利技术的保护范围构成限制。如未特别指出，以下实施例中所使用的试剂和仪器均可通过商业渠道获得。为简便起见，以下实施例中的部分常规技术操作的细节并未予以描述，但可以理解的是，其属于本领域技术人员可知晓并实施的范围内。构建NF-kB结合序列作为荧光素酶(Luciferase)的启动子设计5个NF-kB的结合位点，序列为:GGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCC(SEQIDNO.1)值得注意的是，此处增加至6个结合位点是为了增加NF-kB蛋白的结合域，允许蛋白结合。引入位点为5’末端XhoI和3’末端HindIII。合成该序列(由金斯瑞生物科技公司合成)并克隆到荧光素酶报告基因载体pGL4.22载体中，该pGL4.22载体为Promega公司产品(载体示意图如图1所示)。通过常规操作将NF-kB结合序列构建到该载体中，得到含有NF-kB结合序列和荧光素酶报告基因的质粒pGL4.22-NF-kB。筛选NF-kB-Luciferase阳性细胞株用含有NF-kB结合序列和荧光素酶报告基因的质粒pGL4.22-NF-kB和对照质粒按常规程序转染293F细胞。用含NF-kB结合序列荧光素酶报告基因的质粒pGL4.22-NF-kB(目的质粒)转染293F细胞后，形成单克隆稳定细胞株293F-NF-kB，用序列特异性引物对单克隆细胞株293F-NF-kB进行PCR扩增后测序分析，测序结果如图2所示，显示NF-kB结合序列已经整合入293F细胞基因组中。如图所示，转录因子NF-kB的特异结合序列为GGGAATTTCC，图中测序结果显示共有5个结合位点。上述序列特异性引物如下：正向引物：ACAGGGACAGCAGAGATCCA(SEQIDNO.2)；反向引物：TTCCAGGAACCAGGGCGTAT(SEQIDNO.3)。PCR反应条件：95℃15s，58℃30s，72℃30s，30个循环反应。反应体系如下：H2O：12.5μl；10×反应缓冲液：2μl；10μM正向引物：2μl；10μM反向引物：2ul；Taq酶：0.5μl；DNA模板：1μl；总反应体系为20μl。对照质粒启动子区域插入的为随机DNA序列，该序列含有已知的转录因子结合序列。序列信息为：GCTCAGCCACTGTGACAAGGCGCCGCATTAGACGATTGCAGTAGGGAAGTAAAGGGGCCC(SEQIDNO.4)。在目的质粒和对照质粒转染293F细胞后的第二天加入4μg/ml的嘌呤霉素，以杀死没有转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测RANKL靶向治疗药物生物学活性的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：构建转录因子NF‑kB结合序列，然后将所述NF‑kB结合序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，将所述NF‑kB结合序列作为启动子的组成部分，引导荧光素酶报告基因的转录，得到含有所述NF‑kB结合序列和所述荧光素酶报告基因的质粒；步骤二：用含有所述NF‑kB结合序列和所述荧光素酶报告基因的质粒转染细胞；步骤三：接种细胞，同时加入RANKL和所述RANKL靶向治疗药物，然后培养细胞；步骤四：裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定所述RANKL靶向治疗药物的生物学活性。

【技术特征摘要】
1.一种检测RANKL靶向治疗药物生物学活性的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：构建转录因子NF-kB结合序列，然后将所述NF-kB结合序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，将所述NF-kB结合序列作为启动子的组成部分，引导荧光素酶报告基因的转录，得到含有所述NF-kB结合序列和所述荧光素酶报告基因的质粒；步骤二：用含有所述NF-kB结合序列和所述荧光素酶报告基因的质粒转染细胞；步骤三：接种细胞，同时加入RANKL和所述RANKL靶向治疗药物，然后培养细胞；步骤四：裂解细胞，加入荧光素酶的底物，检测荧光强度，以确定所述RANKL靶向治疗药物的生物学活性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，如果同时加入RANKL和RANKL靶向治疗药物后测得的荧光强度低于仅加入RANKL后测得的荧光强度，则...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶才果，梁桂婵，邓新宇，王笑非，
申请(专利权)人：佛山安普泽生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44