荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法及其应用。该方法包括以下步骤：采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段；将pMx1的基因片段插入pGL3‑basic载体luc基因的5'端，再采用PCR扩增得到pMx1‑luc融合基因片段；用pMx1‑luc融合基因片段替代pEGFP‑N1载体中的pCMV和EGFP的基因片段，构建pMx1‑luc质粒，转染细胞，并选出稳定转染细胞株；对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；以梯度稀释的羊干扰素τ标准品制备标准曲线，将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中共孵育，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检羊干扰素τ样品的效价。

Detection of biological activity of sheep interferon - tau by luciferase reporter gene method

The invention discloses a method for detecting the biological activity of sheep interferon_by luciferase reporter gene method and its application. The method includes the following steps: amplifying the pMx1 gene fragment of sheep Mx1 protein by PCR; inserting the pMx1 gene fragment into the 5'end of the Luc gene of pGL3 basic vector, then amplifying the pMx1 Luc fusion gene fragment by PCR; replacing the pCMV and EGFP gene fragments of pEGFP N1 vector with the pMx1 Luc fusion gene fragment. PMx1_luc plasmid was constructed, transfected cells were selected and stable transfected cell lines were selected. The stable transfected cell lines were cloned and cultured. The standard curve was prepared by gradient dilution of sheep interferon_standard, and the sheep interferon_sample was added to the cloned cells for co-incubation, then the fluorescence intensity was detected. The titer of sheep interferon - tau samples was evaluated by standard curve.

【技术实现步骤摘要】
荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法
本专利技术涉及一种荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法，属于干扰素活性检测

技术介绍
干扰素τ广泛应用于抗病毒感染和免疫功能障碍方面的疾病治疗，其作为一种细胞因子通过与靶细胞表明的特定受体结合引起细胞内系列信号转导途径的激活，表现出抗病毒作用或免疫调节作用。目前干扰素τ在细胞内起作用的信号转导途径已经研究的比较透彻，主要是通过激活JAK-STAT信号级联来实现的。干扰素τ与受体结合激活受体相关JAK1和TYK2，使STAT1和STAT2络氨酸磷酸化，磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚体并转移入核，装配干扰素调节因子9(IRF9)形成3聚体的干扰素刺激因子3(ISGF3)。ISGF3与其同源DNA序列(干扰素刺激反应原件，ISREs)结合，直接激活干扰素刺激基因(ISGs)转录，使宿主细胞进入抗病毒状态。ISG抑制病毒的途径主要有，抑制病毒的转录、翻译和核酸复制；降解病毒核酸；改变宿主细胞脂代谢。因此，只要检测到ISGs的启动子活性增加就可以直接反应干扰素τ的生物学活性。Mx蛋白(Mxprorein)是主要的ISGs，干扰素τ可以经JAK-STAT信号转导途径激活Mx启动子(Mxpromoter，pMx)，促进Mx的表达，Mx能够抑制负链RNA病毒复制。在羊中存在Mx1和Mx2两种蛋白，其中Mx1起主要作用。pMx有较好的专一性，它不能被白细胞介素(Interleukin)、肿瘤坏死因子(TumorNecrosisFactor，TNF)等其它细胞因子启动。目前检测干扰素生物学活性主要有3种方法，病毒复制抑制、噬斑减少分析和细胞病变抑制。但这3种方法都容易产生较大误差，重复性不好，精确度低。作为改进，随后用表达GFP的重组VSV病毒替代野生型VSV病毒，可以通过荧光蛋白的表达来反映病毒感染复制的数量程度，进而判定IFN对病毒复制的抑制程度，敏感性和重复性显著改善，但仍然存在检测过程耗时过长、不便于大通量样品检测、敏感性不够理想及活病毒生物安全隐患等诸多不足。
技术实现思路
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提供一种利用荧光素酶报告基因(luc)检测羊干扰素τ生物学活性的方法，能够简化检测过程，不需要重复进行病毒培养或质粒转染的繁琐操作，提高准确性和重复性，避免了可能存在的生物安全危害。本专利技术的目的通过以下技术方案得以实现：一种荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法，其包括以下步骤：采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段；将PCR扩增获得的羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic载体luc基因的5'端，再采用PCR扩增得到pMx1-luc融合基因片段；用pMx1-luc融合基因片段替代pEGFP-N1载体中的pCMV和EGFP的基因片段，构建pMx1-luc质粒；用pMx1-luc质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；以梯度稀释的羊干扰素τ标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检羊干扰素τ样品的效价。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中，需要孵育一定的时间，一般6小时左右。本专利技术中，pMx1是指羊Mx1基因启动子区域，pCMV是指pEGFP-N1质粒的CMV启动子区域。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的：pMx1的基因片段序列为序列1所示；pMx1-luc融合基因片段序列为序列2所示。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段的步骤包括：根据Genebank中已公布的羊Mx1蛋白的基因序列，选择5'端含有ISRE反应元件的启动子区域，设计PCR引物，进行PCR扩增，得到扩增产物pMx1基因片段；将扩增产物进行双酶切，再通过切胶回收纯化获得pMx1的基因片段。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段将扩增产物进行双酶切的步骤中选用的酶为KpnI和HindIII。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，将PCR扩增获得的羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic载体luc基因的5'端，再采用PCR扩增得到pMx1-luc融合基因片段的步骤包括：通过T4DNA连接酶将pMx1的基因片段连入pGL3-Basic质粒luc基因的5'端；转化大肠杆菌DH5τ感受态细胞，摇菌，筛选出阳性克隆后提取重组pGL3-basic质粒，通过DNA测序获得重组pGL3-basic质粒的pMx1片段的DNA序列，选择含正确序列的重组pGL3-basic质粒；以含正确序列的重组pGL3-basic质粒的DNA序列为模板，设计PCR引物，进行PCR扩增，得到产物；将产物进行双酶切，再通过切胶回收纯化获得pMx1-luc融合基因片段。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，将PCR扩增获得的羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic载体luc基因的5'端，再采用PCR扩增得到pMx1-luc融合基因片段将产物进行双酶切的步骤中选用的酶为AseI和XbaI。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，用pMx1-luc融合基因片段替代pEGFP-N1载体中的pCMV和EGFP的基因片段，构建pMx1-luc质粒的步骤包括：去除pEGFP-N1载体质粒中的pCMV和EGFP的基因片段；通过T4DNA连接酶用pMx1-luc融合基因片段替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV和EGFP的基因片段，构建pMx1-luc质粒；转化大肠杆菌DH5τ感受态细胞，摇菌，提取质粒，通过DNA测序获得质粒的pMx1-luc融合基因片段的DNA序列，选择正确序列的质粒；所述正确序列为：pMx1的基因片段序列为序列1所示，pMx1-luc融合基因片段序列为序列2所示。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，设计PCR引物的方法为常规。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，用pMx1-luc质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株的步骤包括：通过转染试剂将pMx1-luc质粒转染至细胞，转染96h后，换成含2μg/mL新霉素的完全培养基持续培养14日，筛选出具有新霉素抗性的细胞，即为稳定转染细胞株。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，所述克隆化培养为将筛选出的稳定转染细胞株通过有限稀释培养法培养，从而获得单个细胞形成的克隆。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，在对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养的步骤中还包括对克隆后的细胞进行检测，通过PCR鉴定细胞基因组中是否含有pMx1-luc融合基因。上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，去除本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法，其包括以下步骤：采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段；将PCR扩增获得的羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3‑basic载体luc基因的5'端，再采用PCR扩增得到pMx1‑luc融合基因片段；用pMx1‑luc融合基因片段替代pEGFP‑N1载体中的pCMV和EGFP的基因片段，构建pMx1‑luc质粒；用pMx1‑luc质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；以梯度稀释的羊干扰素τ标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检羊干扰素τ样品的效价。

【技术特征摘要】
2017.12.05 CN 20171126417911.一种荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法，其包括以下步骤：采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段；将PCR扩增获得的羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic载体luc基因的5'端，再采用PCR扩增得到pMx1-luc融合基因片段；用pMx1-luc融合基因片段替代pEGFP-N1载体中的pCMV和EGFP的基因片段，构建pMx1-luc质粒；用pMx1-luc质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；以梯度稀释的羊干扰素τ标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检羊干扰素τ样品的效价。2.根据权利要求1所述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法，其特征在于：pMx1的基因片段序列为序列1所示；pMx1-luc融合基因片段序列为序列2所示。3.根据权利要求1所述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法，其特征在于，采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段的步骤包括：根据Genebank中已公布的羊Mx1蛋白的基因序列，选择5'端含有ISRE反应元件的启动子区域，设计PCR引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物进行双酶切，再通过切胶回收纯化获得pMx1的基因片段；优选的，采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段将扩增产物进行双酶切的步骤中选用的酶为KpnI和HindIII。4.根据权利要求1所述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法，其特征在于，将PCR扩增获得的羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic载体luc基因的5'端，再采用PCR扩增得到pMx1-luc融合基因片段的步骤包括：通过T4DNA连接酶将pMx1的基因片段连入pGL3-Basic质粒luc基因的5'端；转化大肠杆菌DH5τ感受态细胞，摇菌，筛选出阳性克隆后提取重组pGL3-basic质粒，通过DNA测序获得重组pGL3-basic质粒的pMx1片段的DNA序列，选择含正确序列的重组pGL3-basic质粒；以含正确序列的重组pGL3-basic质粒的DNA序列为模板，设计PCR引物，进行PCR扩增，得到产物；将产物进行双酶切，再...

【专利技术属性】
技术研发人员：张振韬，单雪芹，刘家炉，王亚男，李雅森，徐高涛，蒋敏之，赵雨，
申请(专利权)人：芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34