一种羊干扰素τ生物学活性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种羊干扰素τ生物学活性检测方法及其应用。该方法包括以下步骤：采用PCR扩增获取羊Mx蛋白的Mxp的基因片段；去除pEGFP‑N1载体质粒的pCMV；用PCR扩增获得的羊Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP‑N1载体质粒中的pCMV，构建pEGFP‑N1‑Mxp质粒；用pEGFP‑N1‑Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养，加入羊干扰素τ与克隆化培养后的稳定转染细胞株共孵育，会激活Mx基因启动子活性促进细胞内EGFP的表达，通过激发光源照射后细胞发出荧光的强度与羊干扰素τ的生物学活性呈正相关，因此可以定量评价羊干扰素τ的生物学活性。

A method for detecting biological activity of sheep interferon tau

The invention discloses a method for detecting biological activity of sheep interferon - tau and its application. The method includes the following steps: obtaining Mxp gene fragment of sheep Mx protein by PCR; removing pCMV of pEGFP N1 vector plasmid; replacing pCMV of original pEGFP N1 vector plasmid with Mxp gene fragment of sheep Mx protein by T4DNA ligase; constructing pEGFP N1 Mxp plasmid; and using pEGFP N1 Mxp plasmid. The stable transfected cell lines were screened out by neomycin. The stable transfected cell lines were cloned and cultured, and then co-incubated with the stable transfected cell lines after cloning with sheep interferon_. The activity of Mx gene promoter was activated to promote the expression of EGFP in cells, and the cells irradiated by light source were stimulated to express EGFP. The intensity of fluorescence is positively correlated with the biological activity of IFN_, so the biological activity of IFN_can be quantitatively evaluated.

【技术实现步骤摘要】
一种羊干扰素τ生物学活性检测方法
本专利技术涉及一种羊干扰素τ生物学活性检测方法，属于干扰素活性检测

技术介绍
干扰素(IFN)是细胞和机体受到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素和促细胞分裂素等的作用后，由受体细胞分泌的一种广谱抗病毒糖蛋白。根据干扰素的来源和理化性质，可将其分为I型、II型和III干扰素。I型干扰素包括IFN-τ，IFN-β，和IFN-τ；II型干扰素即IFN-γ；III干扰素即IL-28A，IL-28B和IL-29。IFN-τ有四个主要功能。第一，可以使感染病毒的细胞及其周围细胞进入内源性抗病毒状态，限制病毒的传播；第二，维持天然免疫反应处于平衡状态，促进抗原递呈和NK细胞功能的同时抑制促炎信号通路和细胞因子的产生；第三，激活获得性免疫系统，促进高亲和力抗原特异性T细胞的产生，促进B细胞反应和免疫记忆；第四，具有抑制病毒增殖的作用。IFN-τ的作用机制在25年前已经阐明，IFN与受体结合激活受体相关JAK1和TYK2，使STAT1和STAT2络氨酸磷酸化，磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚体并转移入核，装配IFN调节因子9(IRF9)形成3聚体的IFN刺激因子3(ISGF3)。ISGF3与其同源DNA序列(IFN刺激反应元件，ISREs)结合，直接激活ISGs转录，使宿主细胞进入抗病毒状态。ISG抑制病毒的途径主要有，抑制病毒的转录、翻译和核酸复制；降解病毒核酸；改变宿主细胞脂代谢。因此，只要检测到ISGs的启动子活性增加就可以直接反应IFN-τ的生物学活性。IFN-τ可以经JAK-STAT信号转导途径激活Mx启动子(Mxpromoter，Mxp)，促进Mx的表达，Mx能够抑制负链RNA病毒复制。在羊中存在Mx和Mx2两种蛋白，其中Mx起主要作用。Mxp有较好的专一性，它不能被白细胞介素和肿瘤坏死因子等其它细胞因子启动，能够准确反应IFN-τ生物学功能。目前检测干扰素生物学活性主要有3种方法：病毒复制抑制、噬斑减少分析和细胞病变抑制。但这3种方法都容易产生较大误差，重复性不好，准确度低。最近Mxp-Luciferase(荧光素酶)系统已经开始用于I型干扰素生物学活性检测，该系统检测的是IFN激活Mxp的能力，不存在假阳性；整个过程完全避免VSV等活病毒的使用，没有生物安全的顾虑；检测程序简化，时间大大缩短，在IFN处理细胞后约6h即可完成检测，检测速度快；荧光素酶的表达可以通过仪器检测精确量化，不仅提高了IFN定量的准确性，更便于大量样品的高通量操作。但该方法基于质粒瞬时转染为基础，每次需要准备内参照质粒，并保证质粒转染效率一致才能够得到准确的检测结果，因此在一般实验室很难开展，而且需要使用荧光素酶底物，增加了使用成本。
技术实现思路
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提供一种利用绿色荧光蛋白(EGFP)的羊干扰素τ生物学活性检测方法，该方法不需要内参照质粒，能够简化检测过程，不需要重复进行质粒转染，提高准确性和重复性，实用性更强。本专利技术的目的通过以下技术方案得以实现：一种羊干扰素τ生物学活性检测方法，其包括以下步骤：采用PCR扩增获取羊Mx蛋白的Mxp的基因片段；用PCR扩增获得的羊Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建pEGFP-N1-Mxp质粒；用pEGFP-N1-Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；以梯度稀释的羊干扰素τ标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检羊干扰素τ样品的效价。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中，需要孵育一定的时间，一般6小时左右。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，在稳定转染细胞株中加入羊干扰素τ，会激活Mx基因启动子活性促进细胞内EGFP的表达，通过激发光源照射后细胞发出荧光的强度与羊干扰素τ的生物学活性呈正相关，因此可以定量评价羊干扰素τ的生物学活性。本专利技术中，Mxp是指羊Mx基因启动子区域，pCMV是指pEGFP-N1质粒的CMV启动子区域。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，采用PCR扩增获取羊Mx蛋白的Mxp的基因片段的步骤包括：根据Genebank中已公布的羊Mx蛋白的基因序列，选择5'端含有ISRE反应元件的启动子区域，设计PCR引物，进行PCR扩增；然后通过双酶切后，再通过切胶回收纯化获得Mxp的基因片段。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，设计PCR引物的方法为常规。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，用PCR扩增获得的羊Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建pEGFP-N1-Mxp质粒的步骤包括：去除pEGFP-N1载体质粒的pCMV的基因片段；通过T4DNA连接酶用Mxp的基因片段替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建重组质粒pEGFP-N1-Mxp；转化大肠杆菌DH5τ感受态细胞，摇菌，提取重组质粒，通过DNA测序获得重组质粒的Mxp片段的DNA序列，选择正确序列的重组质粒；所述序列如序列1所示。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，用pEGFP-N1-Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株的步骤包括：通过转染试剂将pEGFP-N1-Mxp质粒转染至细胞，转染96h左右后，换成含2μg/mL左右的新霉素的完全培养基持续培养14日，筛选出具有新霉素抗性的细胞，即为稳定转染细胞株。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，所述克隆化培养为将筛选出的稳定转染细胞株通过有限稀释培养法培养，从而获得单个细胞形成的克隆。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，在对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养的步骤中还包括对克隆后的细胞进行检测，通过PCR鉴定细胞基因组中是否含有Mxp基因。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，Mxp的基因片段序列为序列1所示。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，去除pEGFP-N1载体质粒的pCMV的方法为双酶切法。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，所述细胞为羊肾细胞。上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，所述羊干扰素τ标准品为公布号为CN106367422A的专利所揭示的一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法制备得到的重组羊τ干扰素。本专利技术还提供上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法在对天然或重组羊干扰素τ进行生物学活性检测中的应用。本专利技术构建了以羊Mx基因启动子作为启动子启动EGFP表达的报告基因质粒，转染羊肾细胞，筛选稳定转染细胞株，用梯度稀释的重组羊干扰素τ标准品和待检样品分别与细胞共孵育后，检测细胞中EGFP的发光值，以重组羊干扰素τ标准品制备标准曲线来检测待检样品中羊干扰素τ的生物学活性。该检测方法主要有以下特点：1.与传统方法相比大大缩短了检测时间(由传统的3-7天缩短至6-8小时)，省去了病毒培养或重复进行质粒转染等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羊干扰素τ生物学活性检测方法，其包括以下步骤：采用PCR扩增获取羊Mx蛋白的Mxp的基因片段；用PCR扩增获得的羊Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP‑N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建pEGFP‑N1‑Mxp质粒；用pEGFP‑N1‑Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；以梯度稀释的羊干扰素τ标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检羊干扰素τ样品的效价。

【技术特征摘要】
2017.12.05 CN 20171126421161.一种羊干扰素τ生物学活性检测方法，其包括以下步骤：采用PCR扩增获取羊Mx蛋白的Mxp的基因片段；用PCR扩增获得的羊Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建pEGFP-N1-Mxp质粒；用pEGFP-N1-Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；以梯度稀释的羊干扰素τ标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检羊干扰素τ样品的效价。2.根据权利要求1所述的羊干扰素τ生物学活性检测方法，其特征在于，采用PCR扩增获取羊Mx蛋白的Mxp的基因片段的步骤包括：根据Genebank中已公布的羊Mx蛋白的基因序列，选择5'端含有ISRE反应元件的启动子区域，设计PCR引物，进行PCR扩增；然后通过双酶切后，再通过切胶回收纯化获得Mxp的基因片段。3.根据权利要求1所述的羊干扰素τ生物学活性检测方法，其特征在于，用PCR扩增获得的羊Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建pEGFP-N1-Mxp质粒的步骤包括：去除pEGFP-N1载体质粒的pCMV的基因片段；通过T4DNA连接酶用Mxp的基因片段替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建重组质粒pEGFP-N1-Mxp；转化大...

【专利技术属性】
技术研发人员：单雪芹，刘家炉，赵雨，蒋敏之，李雅森，许高涛，何志远，凡玉芳，
申请(专利权)人：安徽九川生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34