一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法技术

一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术针对目前侵染性克隆构建方法中病毒侵染效率低，基因表达难控制的问题，本发明专利技术提供了一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，具体是利用诱导型启动子构建诱导型病毒侵染性克隆，通过农杆菌介导转化植物，用转基因植物构建突变体库，待突变体发芽后，利用诱导剂诱导病毒侵染，进行突变体的筛选，得到病毒不能被诱导的突变体植物，再结合图位克隆和全基因组测序的方法定位并克隆植物病毒复制必需寄主基因，本发明专利技术适用于一次性大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因。

A method for screening essential host genes of plant viruses by large throughput screening

A method for screening essential host genes for plant virus replication with large throughput belongs to the field of genetic engineering technology. The invention aims at the problems of low virus infection efficiency and difficult gene expression control in the current construction methods of infective cloning. The invention provides a method for screening essential host genes for plant virus replication with large throughput, in particular, constructing infective clones of induced viruses by using inductive promoters and transforming plants through Agrobacterium tumefaciens mediation. The mutant library is constructed by transgenic plants. After the mutant germinates, the inducer induces virus infection and screens mutants to obtain mutant plants whose virus can not be induced. The mutant plants can be located and cloned by map-based cloning and whole genome sequencing. The present invention is suitable for plant virus replication. It is used for the screening of the necessary host genes for plant virus replication.

【技术实现步骤摘要】
一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法。
技术介绍
植物正义RNA病毒的RNA具有侵染性，进入植物细胞后可作为mRNA被细胞的核糖体翻译产生病毒复制所需要的蛋白质(Flasinskietal.,1996)，进而启动病毒的复制、运动等生命过程。植物正义RNA病毒可以通过构建侵染性克隆以方便长期保存，进行改造(Flasinskietal.,1996,Takahashietal.,1997)。目前有许多植物正义RNA病毒的侵染性克隆被报道，总结方法可以归为两类：1)将病毒的全基因组的cDNA插入至组成型启动子，如花棷菜花叶病毒(CaMV)35S启动子下游，通过农杆菌在植物中表达病毒基因组RNA；2)将病毒的全基因组的cDNA插入至原核转录启动子(如SP6和T7)下游，通过体外转录获得病毒全基因组RNA，然后通过机械摩擦接种植物。上述两种方法存在着以下缺陷：1)组成型启动子一旦进入细胞即开始表达，因此不能条件性地控制表达的时间；2)由于RNA的自然特征，原核转录启动子转录过程产生的病毒RNA非常容易被环境中RNA酶降解，造成病毒侵染效率低下。筛选一种植物病毒复制必需寄主基因需要构建一个可以理论上可以覆盖植物基因组所有基因的突变体库，然后通过逐一接种病毒，筛选病毒不能复制的突变体获得。这种方法存在一个明显的缺陷，即需要大量种植突变体至一定株高并逐一进行病毒接种，需要非常大的人力、速度慢、温室以及实验材料。
技术实现思路
针对目前侵染性克隆构建方法中病毒侵染效率低，基因表达难控制的问题，本专利技术提供了一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，包括如下步骤：1)诱导型病毒侵染性克隆的构建：所述表达载体包含农杆菌T-DNA左边界序列、农杆菌T-DNA右边界序列、诱导型启动子、植物正义RNA病毒全长cDNA、真核转录终止子、大肠杆菌和农杆菌复制必需元件和抗性筛选基因，其中，植物正义RNA病毒全长cDNA位于诱导型启动子和真核转录终止子序列之间，农杆菌T-DNA右边界序列位于诱导型启动子上游，农杆菌T-DNA左边界序列位于真核转录终止子下游；获得的诱导型病毒侵染性克隆转化大肠杆菌宿主菌中，获得阳性转化子；2)诱导型病毒侵染性克隆的遗传转化：将步骤1)获得的阳性转化子导入农杆菌，然后将诱导型病毒侵染性克隆转入植物体内，获得转基因植物；3)植物病毒复制必需基因的大通量筛选：用转基因植物构建突变体库，突变体发芽后，利用诱导剂诱导病毒侵染，进行突变体的筛选，得到病毒不能被诱导的突变体植物，结合图位克隆和全基因组测序的方法确定筛选的植物病毒复制必需基因。优选地，所述大肠杆菌的宿主菌为大肠杆菌Trans10，所述农杆菌为农杆菌GV3101。优选地，所述农杆菌T-DNA左边界序列如SEQIDNO:1所示；所述农杆菌T-DNA右边界序列如SEQIDNO:2所示；所述的大肠杆菌和农杆菌复制必需元件的序列如SEQIDNO:3所示。优选地，步骤1)所述植物正义RNA病毒为马铃薯Y病毒属病毒或马铃薯X病毒属病毒；所述的马铃薯Y病毒属病毒包括芜菁花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、李痘病毒、番木瓜环斑病毒、大豆花叶病毒和烟草蚀纹病毒；所述的马铃薯X病毒属病毒包括马铃薯X病毒、马铃薯奥古巴花叶病毒、凤果花叶病毒、车前草花叶病毒和狐尾草花叶病毒。优选地，步骤1)所述植物正义RNA病毒全长cDNA为芜菁花叶病毒的全长cDNA，其序列如SEQIDNO:4所示。优选地，步骤1)所述植物正义RNA病毒全长cDNA为马铃薯X病毒的全长cDNA，其序列如SEQIDNO:5所示。优选地，步骤1)所述的诱导型启动子为雌激素诱导型启动子XVE，其序列如SEQIDNO:6所示。优选地，步骤1)所述抗性筛选基因为潮霉素基因，序列如SEQIDNO:7所示，所述潮霉素基因，其上游为雌激素诱导型启动子XVE-1，其序列如SEQIDNO:8所示，其下游为雌激素诱导型启动子XVE-2，其序列如SEQIDNO:9所示；步骤1)所述的植物正义RNA病毒全长cDNA，其上游的启动子为雌激素诱导型启动子XVE-2。优选地，步骤1)所述真核转录终止子为T3A终止子，其序列如SEQIDNO:10所示。优选地，步骤3)所述的突变体筛选采用雌激素诱导法。本专利技术步骤1)所述的诱导型病毒侵染性克隆转入植物体内是利用农杆菌介导法或基因枪法实现的，步骤2)所述的转化植物为拟南芥Col-0生态型或普通烟草；步骤3)所述的突变体库构建方法采用T-DNA法或EMS诱变法；所述的植物病毒复制必需寄主基因的筛选是结合图位克隆和全基因组测序法来确定目的基因，当转化的植物为拟南芥时，通过基因定位获得的基因，该基因中插入带有除草剂抗性基因的T-DNA序列，则确定其为植物病毒复制必需寄主基因；当转化的植物为烟草时，通过基因定位获得的基因，该基因与参考基因(即未突变的基因)核苷酸序列相比带有可引起编码氨基酸发生变化或编码氨基酸提前终止的核苷酸突变，则确定其为植物病毒复制必需寄主基因。有益效果本专利技术涉及一种大通量筛选植物正义RNA病毒复制、运动相关的必需寄主基因的方法。本方法可一次性进行大量突变体的筛选，因此可节省大量的时间、实验材料和经费，提高效率。附图说明图1诱导型TuMV侵染性克隆载体XVE::TuMV-GFP载体图谱。图2诱导型PVX侵染性克隆载体XVE::PVX-GFP载体图谱。具体实施方式LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，PH7.5；LB固体培养基：每升LB液体培养基加15g～20g琼脂粉；MS固体培养基：购自美国PhytoTech公司，货号：M401；GibsonAssemblyMasterMix试剂盒购买自NEBBiolabs公司，货号：E2611；大肠杆菌Trans10感受态细胞购买自全式金生物技术有限公司，货号：CD101；EasyPurePlasmidMiniPrepKit试剂盒提取购买自全式金生物技术有限公司，货号：EM101；EasyPurePCRPurificationKit试剂盒提取购买自全式金生物技术有限公司，货号：EP101；雌激素诱导剂购买自西格玛奥德里奇公司，货号：E8875；除草剂购买自北京酷来搏科技有限公司，货号：CB2471；植物生长箱购买自武汉瑞华仪器设备有限责任公司，货号：AR1200，其用来培养拟南芥的条件为：光周期为18小时光照，6小时黑暗；温度为23℃；黑光灯购买自美国UVP公司，货号UVGL-55；其他试剂或仪器如无特殊说明，均可通过现有的商业化途径购买获得。实施例1：大通量筛选芜菁花叶病毒复制必需寄主基因的方法。步骤1.诱导型芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)侵染性表达载体构建。1)为了更加直观简便对转化有诱导型病毒载体的转基因作物后代进行筛选，本实施例利用带有绿色荧光标记基因GFP标签的TuMV侵染性质粒pCambia-TuMV-GFP为模板，该pCambia-TuMV-GFP质粒中包含了一个在编码P1和HcPro蛋白之间插入有编码绿色荧光蛋白(GFP)序列的TuMV基因组(TuMV-GFP)，见SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)诱导型病毒侵染性克隆的构建：所述表达载体包含农杆菌T‑DNA左边界序列、农杆菌T‑DNA右边界序列、诱导型启动子、植物正义RNA病毒全长cDNA、真核转录终止子、大肠杆菌和农杆菌复制必需元件和抗性筛选基因，其中，植物正义RNA病毒全长cDNA位于诱导型启动子和真核转录终止子序列之间，农杆菌T‑DNA右边界序列位于诱导型启动子上游，农杆菌T‑DNA左边界序列位于真核转录终止子下游；获得的诱导型病毒侵染性克隆转化大肠杆菌宿主菌中，获得阳性转化子；2)诱导型病毒侵染性克隆的遗传转化：将步骤1)获得的阳性转化子导入农杆菌，然后将诱导型病毒侵染性克隆转入植物体内，获得转基因植物；3)植物病毒复制必需基因的大通量筛选：用转基因植物构建突变体库，突变体发芽后，利用诱导剂诱导病毒侵染，进行突变体的筛选，得到病毒不能被诱导的突变体植物，结合图位克隆和全基因组测序的方法确定筛选的植物病毒复制必需基因。

【技术特征摘要】
1.一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)诱导型病毒侵染性克隆的构建：所述表达载体包含农杆菌T-DNA左边界序列、农杆菌T-DNA右边界序列、诱导型启动子、植物正义RNA病毒全长cDNA、真核转录终止子、大肠杆菌和农杆菌复制必需元件和抗性筛选基因，其中，植物正义RNA病毒全长cDNA位于诱导型启动子和真核转录终止子序列之间，农杆菌T-DNA右边界序列位于诱导型启动子上游，农杆菌T-DNA左边界序列位于真核转录终止子下游；获得的诱导型病毒侵染性克隆转化大肠杆菌宿主菌中，获得阳性转化子；2)诱导型病毒侵染性克隆的遗传转化：将步骤1)获得的阳性转化子导入农杆菌，然后将诱导型病毒侵染性克隆转入植物体内，获得转基因植物；3)植物病毒复制必需基因的大通量筛选：用转基因植物构建突变体库，突变体发芽后，利用诱导剂诱导病毒侵染，进行突变体的筛选，得到病毒不能被诱导的突变体植物，结合图位克隆和全基因组测序的方法确定筛选的植物病毒复制必需基因。2.根据权利要求1所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，所述大肠杆菌的宿主菌为大肠杆菌Trans10，所述农杆菌为农杆菌GV3101。3.根据权利要求1所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，所述农杆菌T-DNA左边界序列如SEQIDNO:1所示；所述农杆菌T-DNA右边界序列如SEQIDNO:2所示；所述的大肠杆菌和农杆菌复制必需元件的序列如SEQIDNO:3所示。4.根据权利要求1所述的一种大通量筛选植物病毒复制必需寄主基因的方法，其特征在于，步骤1)所述植物正义RNA病毒为马铃薯Y病毒属病毒或马铃...

【专利技术属性】
技术研发人员：程晓非，武晓云，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23