一种真菌防御素的重组制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种真菌防御素的重组制备方法及其应用。本发明专利技术通过Overlap PCR构建了四种真菌防御素的基于pET‑32a载体框架的重组表达载体，成功表达出融合蛋白Trx‑Bldesin、Trx‑Atesin‑1、Trx‑Arbesin、Trx‑micasin‑1；通过Trx‑Bldesin结合酶切和HPLC纯化实验，成功获得Bldesin小肽。活性检测显示，重组Bldesin小肽具有抗菌、抑制丝氨酸蛋白酶和抑制Kv1.3钾通道等多种功能，具有潜在应用价值。本发明专利技术所述真菌防御素的重组制备方法克服了现有技术中真菌防御素重组表达困难的技术障碍，为真菌防御素的工业化生产奠定基础。

A recombinant preparation method of fungal defensins and its application

The invention provides a recombinant preparation method and application of fungal defensins. The recombinant expression vectors of four fungal defensins based on pET 32A vector framework were constructed by Overlap PCR, and the fusion proteins Trx Bldesin, Trx Atesin 1, Trx Arbesin, Trx micasin 1 were successfully expressed; Bldesin small peptide was successfully obtained by Trx Bldesin combination with enzyme digestion and HPLC purification experiments. Activity detection showed that recombinant Bldesin small peptide had many functions, such as anti-bacterial, inhibiting serine protease and inhibiting Kv1.3 potassium channel, and had potential application value. The recombinant preparation method of the fungal defensin overcomes the technical obstacle of difficult recombinant expression of the fungal defensin in the prior art, and lays a foundation for the industrialized production of the fungal defensin.

【技术实现步骤摘要】
一种真菌防御素的重组制备方法及其应用
本专利技术属于基因工程、生物工程和生物医药领域，具体涉及一种真菌防御素的重组制备方法及其应用。
技术介绍
防御素广泛分布于生物界，富含半胱氨酸，是内源抗菌肽中的一个家族成员，一般由29-54个氨基酸残基构成小分子多肽，有6-8个半胱氨酸，通过二硫键使多肽形成反向平行的β-折叠，有些防御素还有α-螺旋结构。防御素具有多种生物学活性，可以杀死真菌、细菌、病毒等微生物，还有免疫调节、细胞毒性、神经损伤修复等生物学功能。根据半胱氨酸之间二硫键的形成方式，防御素可以分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素、植物防御素和昆虫防御素等5大类。近年来，一种与动物毒素具有相似结构的防御素类多肽(DLP)从一种腐生真菌中分离出来，其具有有效的治疗作用，并且毒性低，在血清中有较高的稳定性，因此成为一种很有吸引力的抗感染试剂的候选药物。根据序列比对、结构和生物系统学分析，可以将DLP分为三个家族：Plectasin、Micasin、Eurocin(Wu,Gaoetal.2014)。Plectasin是第一个从真菌中分离出来的防御素类多肽，具有抗菌活性，它由40个氨基酸组成，分子内六个半胱氨酸形成3对二硫键，Cys1-Cys5,Cys2-Cys4,Cys3-Cys6，具有植物和动物的防御素类抗菌肽中保守的CSαβ三级结构。Plectasin尤其对革兰氏阳性菌有较好的抑制作用，可以抑制诸如链球菌和金黄色酿脓葡萄球菌(MRSA)(Saido-Sakanaka,Ishibashietal.2004)。Plectasin可以结合于细菌细胞壁的二类亚型脂质体，插入细菌细胞壁中，破坏细胞壁的形成，从而抑制细菌的增殖(Schneider,Kruseetal.2010)，类似于万古霉素和青霉素对细菌的抑制作用。Micasin从皮肤真菌中分离得到，具有治疗活性，三级结构也是二硫键结合稳定的经典的CSαβ模式，可以抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长，尤其是在微摩尔浓度时能够杀死两种甲氧西林抗性的金黄色酿脓葡萄球菌和绿脓杆菌。Micasin在不破坏细胞膜时作用于细菌3小时，可以杀死将近100％的细菌，显示了极低的溶血作用和在血清中的高度稳定性(Zhu,Gaoetal.2012)。还有两种真菌防御素，一种从阿姆斯特丹散囊菌中分离出来的Eurocin(Oeemig,Lynggaardetal.2012)和从酱油酿造菌米曲霉中分离出来的Oryzeasin，它们不抑制酶促反应，但也结合于细菌细胞壁的二类亚型脂质体上，破坏细菌细胞壁的形成，抑制细菌增殖。真菌防御素具有良好的水溶性、安全无毒、且抑菌谱广、具备保健作用，逐渐成为天然防腐剂研究应用的一个重要方面。然而，真菌防御素在生物体中含量低，难以天然提取，而化学合成方法成本高，无法满足工业化生产的需求，因此，借助于基因工程手段是大规模生产防御素的一条经济有效的途径。但是由于防御素本身具有抗菌功能，因此，利用原核生物重组制备真菌防御素的难度较大，重组多肽的抗菌活性也难以保证，这是目前制约防御素重组制备的两个关键因素。
技术实现思路
基于上述现有技术存在的缺陷，本专利技术通过OverlapPCR构建了四种真菌防御素的基于pET-28a、pET-32a、pGEX-6p-1、pGEX-4T-1载体框架的多种重组表达载体，通过蛋白小试、SDS-PAGE凝胶电泳摸索表达条件，发现真菌防御素与pET-32a重组表达载体在沉淀和上清中，成功表达出融合蛋白Trx-Bldesin、Trx-Atesin-1、Trx-Arbesin、Trx-micasin-1。据此，通过EK酶和TEV酶等不同的蛋白酶切割融合蛋白，然后再根据表达的蛋白标签纯化蛋白，最后过HPLC分离纯化蛋白，成功获得Bldesin小肽。活性检测显示，重组Bldesin小肽具有抗菌、抑制丝氨酸蛋白酶和抑制Kv1.3钾通道等多种功能，具有潜在应用价值。本专利技术目的通过以下技术方案来实现：本专利技术提供了一种真菌防御素，所述真菌防御素包含具有选自SEQIDNO.1-4之一的氨基酸序列的多肽。本专利技术提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述真菌防御素；优选的，所述核酸分子包含选自SEQIDNO.5-8之一的核苷酸序列。本专利技术提供了一种载体，所述载体包含上述分离的核酸分子；优选的，所述载体基于pET-32a载体框架构建。本专利技术提供了一种非人细胞，所述细胞包含编码上述真菌防御素的所述分离的核酸分子或上述重组载体。本专利技术提供了一种真菌防御素的重组制备方法，包括如下步骤：(1)获得编码本专利技术所述真菌防御素的核酸分子；(2)构建包含步骤(1)所述核酸分子的表达载体，优选pET-32a载体框架；(3)IPTG诱导重组真菌防御素表达；(4)纯化重组真菌防御素多肽。进一步的，编码本专利技术所述真菌防御素的核酸分子可通过化学合成或PCR的方式获得；优选overlapPCR；更优选使用SEQIDNO.9-40所示引物序列进行扩增。进一步的，构建重组表达载体时，编码本专利技术所述真菌防御素的核酸分子携带蛋白酶识别位点的编码核酸，还携带有蛋白纯化标签；蛋白酶优选TEV和EK。进一步的，所述纯化步骤包括：1)半透膜透析步骤；2)酶切步骤；3)HPLC纯化步骤。进一步的，本专利技术还提供了所述编码真菌防御素的核酸分子、所述载体和/或所述细胞在制备重组真菌防御素中的应用。进一步的，本专利技术还提供了本专利技术所述真菌防御素、所述编码真菌防御素的核酸分子、所述载体和/或所述细胞在制备抗菌组合物中的应用，所述抗菌组合物优选为抑菌剂。本专利技术的有益效果是：1、选择了恰当的重组表达载体重组表达真菌防御素Bldesin、Atesin-1、Arbesin和micasin-1，使重组融合蛋白释放至培养液上清，便于蛋白纯化，为真菌防御素的工业化生产奠定基础和提供帮助。2、验证了重组真菌防御素的抗菌功能，为抗菌/抑菌剂的开发提供新的活性分子。附图说明图1.真菌防御素目的片段扩增产物凝胶电泳检测：A.Bldesin的DNA凝胶电泳图谱；B.真菌防御素Atesin-1、Arbesin和micasin-1的pET-32a载体TEV酶切位点的DNA凝胶电泳图谱；C.真菌防御素Atesin-1、Arbesin和micasin-1的pET-32a载体EK酶切位点的DNA凝胶电泳图谱。图2.真菌防御素BldesinHPLC纯化的峰图和MS质谱检测：A.真菌防御素Bldesin原始核酸序列和对应蛋白序列；B.真菌防御素Bldesin的HPLC分离纯化；C.真菌防御素Bldesin的质谱鉴定。图3.真菌防御素Bldesin的功能检测(细菌和离子通道Kv1.3)：A.真菌防御素Bldesin抗革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的检测；B.真菌防御素Bldesin抗革兰氏阴性细菌大肠杆菌的检测；C.真菌防御素Bldesin抗革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的生长曲线检测；D，真菌防御素Bldesin抑制钾通道Kv1.3功能检测。图4.真菌防御素Bldesin的功能检测(丝氨酸蛋白酶)：A.真菌防御素Bldesin的APTT检测；B.真菌防御素Bldesin的PT检测；C.真菌防御素Bldesin的plasmin抑制活性检测；D.真菌防御本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真菌防御素，其特征在于，所述真菌防御素包含具有选自SEQ ID NO.1‑4之一的氨基酸序列的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种真菌防御素，其特征在于，所述真菌防御素包含具有选自SEQIDNO.1-4之一的氨基酸序列的多肽。2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述真菌防御素；优选的，所述核酸分子包含选自SEQIDNO.5-8之一的核苷酸序列。3.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述分离的核酸分子；优选的，所述载体基于pET-32a载体框架构建。4.一种非人细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求2所述分离的核酸分子或权利要求3所述载体。5.一种真菌防御素的重组制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)获得编码权利要求1所述真菌防御素的核酸分子；(2)构建包含步骤(1)所述核酸分子的表达载体，优选pET-32a载体框架；(3)IPTG诱导重组真菌防御素表达；(4)纯化重组真菌防御素多肽。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宗运，罗旭东，丁莉，周明华，叶祥东，
申请(专利权)人：湖北医药学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42