一种提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组织培养方法技术

本发明专利技术属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组织培养方法。该方法利用一组组合培养基提高大叶金丝楸新梢分化数量，该组合培养基包括诱导培养基、分化培养基和生长培养基。提高大叶金丝楸新梢分化数量的组织培养方法中，包括：建立无菌体系、两步接力方式继代培养、诱导生根培养、炼苗、移栽等步骤。本申请所提供大叶金丝楸组培方法，一方面通过培养基组分的优化调整，另一方面在继代培养过程中调整培养方式，通过采用两步接力的方式在特定培养基进行组培苗继代培养，在不延长总体培养时间的同时，兼顾了增殖与生长过程，增加了有效新梢数量，同时较好避免了组培过程中玻璃化现象发生。

An improved tissue culture method for effective shoot differentiation in Catalpa bungei

The invention belongs to the technical field of plant tissue culture, and in particular relates to a tissue culture method for improving the number of effective shoot differentiation of Sorbus japonica. In this method, a set of combination media was used to increase the number of new shoot differentiation of Sorbus macrophylla, which included induction medium, differentiation medium and growth medium. Tissue culture methods to increase the number of differentiation of new shoots of Catalpa grandis include: establishing aseptic system, two-step relay subculture, inducing rooting culture, seedling training, transplanting and so on. This application provides a tissue culture method for Catalpa mandshurica. On the one hand, by optimizing and adjusting the composition of the culture medium, on the other hand, by adjusting the culture mode in the process of subculture, the tissue culture seedlings of Catalpa mandshurica are subcultured in a specific culture medium by two-step relay method, which takes into account both proliferation and growth without prolonging the overall culture time. In the long process, the number of effective shoots was increased, and the vitrification phenomenon in tissue culture was avoided.

【技术实现步骤摘要】
一种提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组织培养方法
本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及一种提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组织培养方法。
技术介绍
楸树（CatalpabungiC.A.Mey）是我国较为古老的树种之一，具有一系列优点，主要有：树干通直、树形美观、花色粉红特点；具有较强的消声、滞尘能力，对有害气体有较强的吸收作用；其自花授粉结实力差，没有落果污染环境，同时叶片落期集中，便于清扫；材质优良，加工应用领域广泛。金丝楸（Catalpabungivar.）是楸树的一个地理变种，而大叶金丝楸则是从金丝楸实生后代群体中选育出来的一个优良无性系，与金丝楸相比，具有叶片大、生长速度快、材质优良等特点，既可营造速生丰产林，也可用作防护林，同时又是理想的农林间作树种，还是很好的城市绿化树种，集用材、防护、观赏、环保等多项功能于一体，应用前景非常广阔，在生产中需求旺盛。楸树自古以来一直延用“取傍生者植之”的方法繁衍，进而逐渐形成了单一无性系，但由于这种繁殖方法的繁殖速度较慢，受限较多，因而使楸树的种植发展受到很大限制。为适应绿化栽培的大量需求，采用植物组织培养的方法快速繁殖大叶金丝楸种苗，是推广大叶金丝楸种植和满足市场需求的重要技术手段。就植物组培快繁种苗生产而言，一般而言，不仅要有稳定的增殖系数能够继代扩繁，还要确保足够数量用于生根培养的有效新梢，才能使种苗生产顺利进行。而就金丝楸的组培技术研究而言，对现有采用单一培养基进行金丝楸增殖的技术（翟晓巧等，金丝楸茎段的组织培养及植株再生技术研究，河南农业大学学报，2002，36(4):319-321，培养基为WPM+IBA0.3mg/L+6-BA5mg/L）研究后发现，由于培养基中含有较高浓度的6-BA（5mg/L），采用此方法进行大叶金丝楸组培快繁育苗时，随着继代次数的增加，组培苗容易出现愈伤组织大、苗矮小、玻璃化等问题，造成增殖不稳定，能够用于继代或生根培养的有效新梢分化数量少（如附图2所示），难以满足组培工厂化育苗生产要求。因此，建立一种操作简单、增殖稳定、获得有效新梢分化数量多的组培方法，对大叶金丝楸的种苗繁育及产业发展具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种两步接力增殖提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组织培养方法，从而为大叶金丝楸的组培体系的建立和种植推广奠定理论和应用基础。本申请的主要技术方案详述如下。一组用于提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组合培养基，该组合培养基用以提高组培过程中大叶金丝楸有效新梢分化数量，包括诱导培养基、分化培养基和生长培养基；所述诱导培养基，MS（或WPM）培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.8mg/L+NAA（IBA或IAA）0.1mg/L；较优配方为：WPM培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.8mg/L+IBA0.1mg/L；所述分化培养基，WPM培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.6～3.0mg/L+IBA0.1～0.3mg/L；较优配方为：WPM培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA1.0~2.0mg/L+IBA0.1～0.2mg/L；最优配方为：WPM培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA2.0mg/L+IBA0.1mg/L；所述生长培养基，MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.8～1.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L；较优配方为：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.8mg/L+IBA0.5mg/L。所述用于提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组合培养基，还包括生根培养基，所述生根培养基，以MS为基本培养基，其中大量元素减半，附加IBA0～0.8mg/L、NAA0～0.5mg/L、活性炭（AC）0～1g/L、蔗糖20g/L、琼脂6g/L；较优配方为：1/2MS培养基+IBA0.8mg/L+NAA0.08mg/L+活性炭（AC）0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L。利用所述组合培养基的提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组织培养方法，包括如下步骤：（1）建立无菌体系采集大叶金丝楸外植体，灭菌后，采用诱导培养基培养形成不定芽，从而建成无菌体系；所述诱导培养基以MS或WPM为基本培养基，额外加入：6-BA0.8mg/L，NAA0.1mg/L（也可采用IBA或IAA替代NAA，替代后浓度相同），蔗糖30g/L和琼脂6g/L；无菌体系构建过程中，培养条件要求为：温度23±2℃，光照强度2000Lx，光照时间7h/d；将消毒后外植体接种诱导培养基后，2～5d外植体开始萌动，培养12~15d左右形成不定芽，此时即可认为无菌株系已建成；大叶金丝楸外植体的选择标准为：春季取大叶金丝楸生长健壮的新萌发枝条，剪去叶片，保留1cm左右叶柄，将此方式处理后的茎段作为外植体；对外植体的具体消毒方式为：将外植体在自来水下冲洗1遍，再用肥皂水刷洗5～20min，然后自来水流水冲洗30min；在超净工作台上，将外植体剪成长3～4cm、带1～3个腋芽的小茎段，用无菌水冲洗1遍后放入无菌组培瓶中，每瓶中放外植体约10个；75%酒精浸泡20s，无菌水冲洗1遍；0.1%升汞滴加1滴吐温80，灭菌8～12min；最后用无菌水冲洗4次，每次3～4min；整个消毒灭菌过程中不断摇动无菌瓶，使消毒剂与外植体充分接触；（2）两步接力方式继代培养分切步骤（1）中诱导形成的不定芽，然后接种于第一步分化培养基中，培养10～20d，促使不定芽基部形成愈伤组织，并进一步分化形成不定芽丛；然后转接入第二步生长培养基，继续培养10～20d，以使丛生芽继续生长，并增加有效新梢数量，待所形成新梢高度不小于2cm时，进行后续诱导生根培养；而对高度不足2cm新梢及丛生芽继续进行上述两步接力方式的继代培养；所述分化培养基，以WPM为基本培养基，附加6-BA0.6～3.0mg/L、IBA0.1～0.3mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L；所述生长培养基，以MS为基本培养基，附加6-BA0.8～1.0mg/L、IBA0.1～0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，继代培养过程中，培养条件为：温度23±2℃，光照强度2000Lx，光照时间7h/d；（3）诱导生根培养切取步骤（2）中生长健壮且高度不小于2cm的新梢，接种到生根培养基上进行生根培养30d左右，以形成生根苗（在接种生根培养基后，一般7～10d时即可见根尖形成）；所述生根培养基，以MS为基本培养基，其中大量元素减半，附加IBA0～0.8mg/L、NAA0～0.5mg/L、活性炭（AC）0～1g/L、蔗糖20g/L、琼脂6g/L，生根培养过程中，培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度2000Lx，光照时间12h/d；（4）炼苗、移栽将步骤（3）中的生根幼苗置于温室中，敞开培养瓶口，炼苗5~10天左右（一般炼苗一周），然后将生根幼苗从培养瓶中取出，清水洗掉基部培养基，用有效成分含量50%的多菌灵800倍液浸泡1min，移栽入草炭：珍珠岩体积比为2:1的基质中；移栽初期扣小拱棚保湿，保证棚内湿度在95%以上，10d后逐渐掀开棚膜通风，正常管理即可。本申请所提供大叶金丝楸组培方法，一方面通过培养基组分的优化调整本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组用于提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组合培养基，其特征在于，该组合培养基用于组培过程中提高大叶金丝楸有效新梢分化数量，包括诱导培养基、分化培养基和生长培养基；所述诱导培养基，MS培养基或WPM培养基+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L+6‑BA 0.8mg/L+NAA 或IBA或IAA 0.1 mg/L；所述分化培养基，WPM培养基+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L+6‑BA 0.6～3.0mg/L+IBA 0.1～0.3mg/L；所述生长培养基，MS培养基+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L+6‑BA 0.8～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L。

【技术特征摘要】
1.一组用于提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组合培养基，其特征在于，该组合培养基用于组培过程中提高大叶金丝楸有效新梢分化数量，包括诱导培养基、分化培养基和生长培养基；所述诱导培养基，MS培养基或WPM培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.8mg/L+NAA或IBA或IAA0.1mg/L；所述分化培养基，WPM培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.6～3.0mg/L+IBA0.1～0.3mg/L；所述生长培养基，MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.8～1.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L。2.如权利要求1所述用于提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组合培养基，其特征在于，该组合培养基包括生根培养基，所述生根培养基，以MS为基本培养基，其中大量元素减半，附加IBA0～0.8mg/L、NAA0～0.5mg/L、活性炭0～1g/L、蔗糖20g/L、琼脂6g/L。3.如权利要求2所述用于提高大叶金丝楸新梢分化数量的组合培养基，其特征在于，该组合培养基具体为：所述诱导培养基，WPM培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.8mg/L+IBA0.1mg/L；所述分化培养基，WPM培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA1.0~2.0mg/L+IBA0.1～0.2mg/L；所述生长培养基，MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.8mg/L+IBA0.5mg/L；所述生根培养基，1/2MS培养基+IBA0.8mg/L+NAA0.08mg/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳敏，王利民，董晓宇，张和臣，符真珠，师曼，蒋卉，王慧娟，高杰，王耀瑭，崔巍，袁欣，冯乃曦，张晶，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南,41