8-羟基脱氧鸟苷检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种8‑羟基脱氧鸟苷检测试剂盒及对8‑羟基脱氧鸟苷的检测方法。本发明专利技术的检测试剂盒包括：试剂A：NaH2PO4溶液；试剂B：流动相溶剂。对8‑羟基脱氧鸟苷的检测方法包括：1)预处理待测样本；2)设定检测参数；3)对样本进行检测。本发明专利技术的检测试剂盒改善了现有技术中使用磷酸二氢钾做流动相时色谱柱柱压大，而且容易堵塞色谱柱和色谱仪的四元泵的问题，以及易干扰不准确的问题。进一步，可以实现样本与高效液相色谱的联用，从而实现自动检测。本发明专利技术的检测方法准确、简单、专属性强、精密度良好、回收率良好。本发明专利技术还提供了所述8‑OHdG检测试剂盒在制备肺癌诊断或肺癌临床治疗效果监测的试剂盒中的应用。

8- hydroxyl deoxy guanosine detection kit and its application

The invention belongs to the field of biological detection technology, in particular to an 8 hydroxydeoxyguanosine detection kit and a detection method for 8 hydroxydeoxyguanosine. The detection kit includes: reagent A:NaH2PO4 solution; reagent B: mobile phase solvent. The detection methods of 8 hydroxydeoxyguanosine include: 1) pretreatment of the samples to be tested; 2) setting detection parameters; 3) detection of samples. The detection kit of the invention improves the problems of high column pressure when potassium dihydrogen phosphate is used as mobile phase in the prior art, easy blockage of the Quaternary pump of the chromatographic column and the chromatograph, and easy interference and inaccuracy. Furthermore, the combination of samples and high performance liquid chromatography can be realized to achieve automatic detection. The detection method of the invention is accurate, simple, strong specificity, good precision and good recovery rate. The invention also provides the application of the 8 OHdG detection kit in the preparation of a kit for the diagnosis of lung cancer or for monitoring the clinical therapeutic effect of lung cancer.

【技术实现步骤摘要】
8-羟基脱氧鸟苷检测试剂盒及其应用
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种8-羟基脱氧鸟苷的检测方法、检测试剂盒及其应用。
技术介绍
外源性化学物质体内代谢或细胞的正常新陈代谢过程都能产生大量的活性氧(ROS)自由基。ROS主要包括超氧阴离子基团、羟自由基、过氧化氢自由基等。活性氧存在未配对的单电子，具有很强的化学反应活性。过高的活性氧水平会引起对细胞膜脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤。但活性氧寿命极短，不能在人体中直接检测，因而需要选择一种生物分子与活性氧进行非酶反应后的产物作为生物标志物，代替活性氧进行检测，来间接反映机体内活性氧水平。8-羟基脱氧鸟嘌呤(以下简称“8-OHdG”)是活性氧自由基如羟自由基、单线态氧等攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物。研究发现健康人群的年龄、性别、日照时间、身体状态等一般因素对人体内8-OHdG的水平也会产生影响，这些影响在一定程度上都与机体内活性氧的水平相关联。对人体组织或体液中的8-OHdG的含量进行检测，可用来代替活性氧检测，间接反映机体内活性氧水平。目前认为尿液中8-OHdG的含量可以反映机体的DNA氧化程度，是国际上比较公认的一种新型的评价机体的DNA氧化程度和机体氧化应激状态的敏感指标和生物标志物。另外，过量自由基造成的DNA氧化损伤是外来致癌物导致癌变发生的重要机制之一，8-OHdG作为DNA氧化损伤的生物标志物，其表达水平与多种癌基因的突变密切相关，在癌症的发生、发展及预后中扮演着重要角色。有多项研究证明在心血管疾病、糖尿病、退行性疾病、癌症患者尿液中均出现8-OHdG水平的升高，提示这些疾病的发生与DNA的氧化性损伤密切相关。因此，8-OHdG的检测对预测人体某些疾病的发生具有重要的参考意义。但由于8-OHdG并不具有疾病特异性，其只是反映机体内氧化应激状态或者DNA被氧化损伤存在与否，因此对人体组织或体液中8-OHdG的检测结果，还需要结合临床的其他检测结果或患者症状等，才能用于疾病的诊断或辅助诊断。目前8-OHdG的分离检测方法主要有高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD)、32P后标记-薄层色谱法(32PPostlabel-TLC)、免疫化学分析、荧光后标记、[3H]标记-HPLC、高效毛细管电泳法(HPCE)及气相色谱-质谱法(GC-MS)等。然而，上述方法都存在一定的缺陷，而无法用于临床中对人体组织或体液中8-OHdG的含量测定。例如：GC-MS法需先衍生化反应，衍生过程易产生副产物，导致假阳性结果。32P后标记法的特异性有待提高,且易造成放射性污染。免疫化学法的专属性差，尿液中的尿素会与8-OHdG发生交叉反应，导致检测值较真实值偏高。目前主要利用高效液相色谱-电化学检测法(HPLC-ECD)来测定8-OHdG，但此法存在不完全酶解、干扰物质同时被洗出的问题,可导致对8-OHdG的检测值比真实值偏高；此外仪器成本高，较难在临床上推广。目前仍然需要改进8-OHdG的检测方法，尤其是寻找到适合实际检验需要的用于大量样本的稳定的检测方法，例如，临床样本的检测。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术通过方法学研究和大量样本的反复验证，建立了适于实际检测应用的8-羟基脱氧鸟苷检测方法以及相应的试剂盒，该方法可准确、快速地测定尿液样本或其他组织样本中8-羟基脱氧鸟苷的含量；并且，本专利技术发现尿液中8-羟基脱氧鸟苷的水平，对肿瘤患者的诊断以及肿瘤治疗效果的监测具有指导意义，可以在临床中作为辅助诊断和参考使用。本专利技术的技术方案如下：本专利技术的第一个方面是，提供一种8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)检测试剂盒。根据本专利技术，所述检测试剂盒包括分别独立存在的：试剂A：NaH2PO4；试剂B：流动相溶剂。根据本专利技术，所述试剂A可以任何形式，如固体或溶液等形式提供。对于以溶液形式提供的试剂A，并不特别限定其浓度，可以配制成1×工作液的浓度，或者配置成2×或2×以上工作液的浓度，例如5×工作液的浓度等。在本专利技术的一个实施方式中，试剂A以溶液的形式提供，配置成1×工作液的浓度。在本专利技术的一个优选实施方式中，试剂A的1×工作液的浓度为45-55mmol/L，优选为50mmol/L。根据本专利技术，当所述试剂A以溶液形式提供时，试剂A的1×工作液的pH可以为3.3-3.7，优选为3.5。根据本专利技术，所述流动相溶剂可以为甲醇或乙腈，例如为甲醇。根据本专利技术，当所述试剂A以溶液形式提供时，试剂A的1×工作液的体积与试剂B的体积比为(8.5～9.5)：1，优选为9:1。根据本专利技术，所述8-OHdG检测试剂盒还可以包括独立存在的酸性溶液。所述酸性溶液用于酸化待检测的样品，例如尿液。所述酸性溶液可以选自硝酸溶液、硫酸溶液、盐酸溶液或其他本领域常用的酸性溶液，例如甲酸、乙酸或柠檬酸等。从操作便宜性和材料成本角度出发，优选使用盐酸。在本专利技术的一个实施方式中，所述酸性溶液为2mol/L的盐酸溶液。根据本专利技术，所述8-OHdG检测试剂盒还可以包括独立存在的样本预处理装置。根据本专利技术，所述样本预处理装置可以为过滤装置，例如为可以对本专利技术的尿液样本或其他组织样本进行过滤处理的注射器及与注射器配合使用的过滤膜。根据本专利技术，所述8-OHdG检测试剂盒优选与高效液相色谱仪联用，例如与使用色谱柱为AligentEclipseC18的高效液相色谱仪联用。根据本专利技术，所述试剂盒可以任何形式提供，包括但不限于以方形的包装盒形式。根据本专利技术，所述试剂盒中上述独立存在的各试剂和装置可以5样本份或5样本份以上的量提供，例如：10样本份，20样本份，40样本份，100样本份等。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述试剂盒包括独立存在的：试剂A：50mmol/LNaH2PO4溶液，pH＝3.5，2瓶，每瓶180mL；试剂B：甲醇，2瓶，每瓶20mL；试剂C：2mol/L盐酸溶液，1瓶，1.5mL。任选在所述试剂盒中还独立存在10套样本预处理装置：每套包括10ml注射器和过滤膜。本专利技术的第二个方面是，提供一种采用高效液相色谱检测样本中8-OHdG的方法。根据本专利技术，所述方法包括如下步骤：1)预处理待检测样本；2)设定检测参数；3)对样本进行检测。根据本专利技术，步骤1)中，待检测样本可以为尿液样本或其他组织样本，优选为尿液样本。根据本专利技术，步骤1)中，对待检测样本进行预处理为向待检测样本，例如尿液中，加入酸性溶液，将所得混合液进行离心取上清。优选加入酸性溶液使待测样本的pH值为3.3-3.7，例如，可以为3.4、3.5或者3.6等。优选上清进一步进行过滤处理。根据本专利技术，所述酸性溶液具有如上所述的定义。根据本专利技术，步骤1)中，所述酸性溶液为2mol/L的盐酸溶液时，酸性溶液与尿液样本的体积比优选为1:50。根据本专利技术，步骤1)中，所述尿液样本优选为晨尿。根据本专利技术，步骤1)中，所述尿液样本优选不添加任何物质，例如防腐剂。根据本专利技术，步骤1)中，所述待检测样本优选在收集完成后及检测前进行低温保存；如果样本收集后1-12h内完成检测，则优选保存于2℃～8℃，优选4℃；若待检测样本在1个月内检测，优选对待检测样本进行单次使用量(例如：5-10mL)分装并保存于-30℃～-15℃，优选-20℃；若待检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种8‑羟基脱氧鸟苷检测试剂盒，包括分别独立存在的：试剂A：NaH2PO4；试剂B：流动相溶剂；优选所述试剂A以固体或溶液形式提供；优选试剂A以溶液的形式提供；进一步优选试剂A的1×工作液的浓度为45‑55mmol/L，优选为50mmol/L；优选试剂A的1×工作液的pH为3.3‑3.7，优选为3.5；优选所述流动相溶剂为甲醇或乙腈；优选所述试剂A的1×工作液的体积与试剂B的体积比为(8.5～9.5)：1，优选为9:1。

【技术特征摘要】
1.一种8-羟基脱氧鸟苷检测试剂盒，包括分别独立存在的：试剂A：NaH2PO4；试剂B：流动相溶剂；优选所述试剂A以固体或溶液形式提供；优选试剂A以溶液的形式提供；进一步优选试剂A的1×工作液的浓度为45-55mmol/L，优选为50mmol/L；优选试剂A的1×工作液的pH为3.3-3.7，优选为3.5；优选所述流动相溶剂为甲醇或乙腈；优选所述试剂A的1×工作液的体积与试剂B的体积比为(8.5～9.5)：1，优选为9:1。2.如权利要求1所述的试剂盒，进一步包括独立存在的酸性溶液；优选所述酸性溶液选自硝酸溶液、硫酸溶液、盐酸溶液、甲酸、乙酸或柠檬酸；进一步优选为盐酸；更优选为2mol/L的盐酸溶液。3.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒，进一步包括独立存在的样本预处理装置，优选所述样本预处理装置可以为过滤装置，进一步优选为进行过滤处理的注射器及与注射器配合使用的过滤膜。4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，包括独立存在的：试剂A：50mmol/LNaH2PO4溶液，pH＝3.5，2瓶，每瓶180mL；试剂B：甲醇，2瓶，每瓶20mL；试剂C：2mol/L盐酸溶液，1瓶，1.5mL；任选包括独立存在的10套样本预处理装置：每套包括10ml注射器和过滤膜。5.一种采用高效液相色谱检测样本中8-OHdG的方法，包括如...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾慧慧，
申请(专利权)人：凯熙医药武汉股份有限公司，武汉尚宜康健科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42