硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其编码基因制造技术

本发明专利技术涉及一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，是通过密码子优化的方式得到硫氧还蛋白还原酶编码基因，如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示，并将其在大肠杆菌和哺乳细胞中进行表达，得到重组蛋白。本发明专利技术的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白序列完整，经验证其可与现有的TrxR1抗体特异性结合，方法简单，应用广泛。

【技术实现步骤摘要】
硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其编码基因
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其编码基因。
技术介绍
硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxinreductase，TrxR)、硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NADPH)，是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶系统。硫氧还蛋白还原酶是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，包含保守的CysValAsnValGlyCys氧化还原位点，催化依赖硫氧还蛋白NADPH还原反应。硫氧还蛋白还原酶活性检测可评价人体异常增生活性水平，硫氧还蛋白还原酶可实时检测人体内的异常增生活跃程度，由于不可逆恶性增生是肿瘤的重要特征，在癌症的早期阶段该值就会明显升高，因此硫氧还蛋白还原酶是一种特异性、敏感性、广谱性都较高的肿瘤标志物。因此，体外制备硫氧还蛋白还原酶对于相关疾病的诊断和治疗研究具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白(TXNRD1)及其编码基因。本专利技术采用如下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，在氨基酸序列C端添加6个His(HHHHHH)片段，氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示。第二方面，本专利技术提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一个实施方案中，是对硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列密码子优化后，通过基因合成的方式得到编码基因。第三方面，本专利技术还提供重组载体，含有所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因。在本专利技术一个实施方案中，将所述编码基因亚克隆到表达载体，构成重组载体；例如，所述载体为pET28b；在本专利技术另一个实施方案中，将所述编码基因亚克隆到克隆载体，构成重组载体；例如，所述载体为pUC19。第四方面，本专利技术提供所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因的表达方法，包括如下步骤：(1)将硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列密码子优化得到编码基因，利用基因合成的方式得到编码基因，例如，通过线上软件进行氨基酸序列密码子优化；(2)构建重组载体；将PCR扩增的DNA序列和质粒载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组载体；所述载体可以为克隆载体或者表达载体；(3)将重组载体转化到感受态细胞，培养筛选，测序验证；(4)构建表达菌株或表达细胞，表达蛋白；(5)重组蛋白纯化，利用Ni树脂纯化方式纯化。根据本专利技术的表达方法，所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白编码基因由大肠杆菌表达或者由哺乳细胞表达，例如有大肠杆菌或者HEK293细胞表达。在本专利技术一个实施方案中，所述表达方法包括将DNA片段和表达载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组表达载体，将其转化到表达菌株，筛选阳性转化子，将目标表达菌株体外诱导表达，例如表达菌株可选自大肠杆菌，所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示。在本专利技术另一个实施方案中，所述表达方法包括将DNA片段和克隆载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化感受态细胞，经过菌P验证确定目标菌株，大量提取质粒，再瞬间转染到表达细胞，进行细胞培养，表达蛋白，例如表达细胞可选自HEK293细胞，所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。第五方面，本专利技术还提供上述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白在硫氧还蛋白还原酶活性检测中的应用，例如作为参比蛋白或者标准品辅助用于通过酶动力学方法检测离体生物样本中硫氧还蛋白还原酶活性水平，所述生物样本可以是来自生物体的离体血液、唾液、尿液、脑脊液、组织液、体外细胞、组织匀浆等，所述生物体可以是人类或其他哺乳动物。有益效果本专利技术通过密码子优化和基因合成得到了两种可编码硫氧还蛋白还原酶编码基因，并将该编码基因分别在大肠杆菌和哺乳细胞中成功表达，获得了体外表达的硫氧还蛋白还原酶。本专利技术所合成的编码基因表达效率高，且表达得到的硫氧还蛋白还原酶序列完整，经验证其可与现有的TrxR1抗体特异性结合，方法简单，稳定性好，可广泛用于硫氧还蛋白还原酶有关的疾病诊断、治疗研究，突破了现有硫氧还蛋白还原酶产品序列不完整的困境，具有重大意义。附图说明图1:为实施例1重组蛋白的表达测试结果(左：SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝；右：WesternBlot，ECL显色)，其中MW.分子量标记，空白培养基阴性对照，C.培养基，N.细胞破碎上清，D.细胞破碎沉淀，+.带His标签的BSA的阳性对照。图2为实施例1所表达的蛋白纯化后的测试结果，A为SDS-PAGE电泳验证纯化结果，B为样品最终QC，其中MW.分子量标记，IN.流入，FT.流出，W.洗涤，E.洗脱。图3为实施例1表达的蛋白样品与TrxR1兔多抗孵育的Westernblot验证结果。图4为实施例1表达的蛋白样品与HRP标记的TrxR1抗体(SantaCruz)孵育的Westernblot验证结果。图5为实施例2表达的蛋白样品纯化后的测试结果，用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE电泳图谱(左：定性分析，右：缓冲液交换后的最终样品QC，每泳道2μg)；其中MW.分子量标记，In.流入，FT，流出，W.洗涤，E1-E11.洗脱。图6为实施例2表达的蛋白样品与TrxR1兔多抗孵育的Westernblot验证结果。图7为实施例2表达的蛋白样品与HRP标记的TrxR1抗体(SantaCruz)孵育的Westernblot验证结果。图8为实施例3中硫氧还蛋白还原酶活性-吸光度标准曲线。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本专利技术的保护范围不仅限于以下实施例。根据本专利技术公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本专利技术技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本专利技术的保护范围。除特殊说明外，本专利技术实施例所用试剂均可市购获得。主要试剂和仪器来源如表1。表1本专利技术实施例所涉及主要试剂和仪器实施例11.1HEK293细胞表达TXNRD1(1)基因序列的获得和优化从UniProt网站得到TXNRD1的氨基酸序列，选取1-649AAs为表达目的片段，其中648U变为C，C端添加6*His标签，采用密码子优化后进行基因合成，得到编码基因序列SEQIDNO.2。(2)克隆载体的构建PCR扩增步骤(1)得到的DNA片段，将载体pUC19和扩增的DNA片段用限制性内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，其特征在于，所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白在氨基酸序列C端添加6个His(HHHHHH)片段。/n

【技术特征摘要】
1.一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，其特征在于，所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白在氨基酸序列C端添加6个His(HHHHHH)片段。


2.根据权利要求1所述的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示。


3.一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2或SEQIDNO.4所示。


4.根据权利要求3所述的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因，是对硫氧还蛋白还原酶的氨基酸序列密码子优化后，通过基因合成的方式得到编码基因。


5.重组载体，含有权利要求3或4所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因；
优选地，是将所述编码基因亚克隆到载体得到；
优选地，所述载体选自表达载体或者克隆载体；例如，所述表达载体为pET28b；例如，所述克隆载体为pUC19。


6.一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白编码基因的表达方法，包括如下步骤：
(1)将硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列密码子优化得到编码基因，利用基因合成的方式得到编码基因的DNA片段；
(2)构建重组载体；
PCR扩增步骤(1)得到的DNA片段，和载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组载体；优选地，所述载体选自克隆载体或表达载体；
(3)将重组载体转化到感受态细胞，培养筛选，测序验证；
(4)...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹汉维，
申请(专利权)人：凯熙医药武汉股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42