多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种新的能够由多不饱和脂肪酸产生多羟基衍生物的酶和使用该酶产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法。该酶可以在使用多不饱和脂肪酸作为底物的单一反应中产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物，因此可以非常有效地用于多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的离体产生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的制备方法
本专利技术涉及能够由多不饱和脂肪酸产生多羟基衍生物的酶和使用该酶产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法。
技术介绍
由于炎症反应作为机体对病原体感染和各种毒性物质的初级防御发挥重要作用，但同时，炎症反应可以作为引起各种慢性疾病的潜在因素，因此炎症反应是需要通过复杂的体内调节机制严格控制的生理现象。前列腺素(prostaglandin)或白三烯(leucotriene)，花生四烯酸(arachidonicacid，C20:4n-6)的衍生物，其对应于ω-6多不饱和脂肪酸，是代表性的炎症反应起始信号物质，并且诱导能够在体内引起各种慢性疾病的炎症反应的失衡。通常，当炎症反应起始信号物质不产生时，炎症反应被认为是自然终止的，并且，已经开发了各种甾体或非甾体抗炎治疗剂来抑制该物质的产生。但是，近年来，炎症反应的终止机制也是通过复杂的调节过程来进行的，而在该过程中已经证实ω-3多不饱和脂肪酸的羟基衍生物，例如二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA，C22:6n-3)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid，EPA，C20:5n-3)，可以作为在炎症反应的终止机制中起作用的信号物质。那些作为炎症反应终止机制的信号物质的羟基衍生物被称为特异性促消退介质(specializedproresolvingmediators(SPM)；消退素、保护素、Maresins)。已经证实这些羟基衍生物显示出优于现有抗炎治疗剂如皮质类固醇(corticosteroids)和非甾体抗炎药(non-steroidanti-inflammatorydrug，NSAID)、阿司匹林的效果。另外，不同于主要诱导抑制炎症反应起始信号物质产生的常规甾体或非甾体抗炎治疗剂，SPM具有在炎症反应的所有阶段都显示功效的优点。因此，对于各种慢性炎症性疾病(血管、心肌梗塞、中风、痴呆、骨关节炎、哮喘等肺病、胃肠炎、牙周炎、干眼综合征、脂肪肝等各种慢性炎症性疾病)、败血症感染、烧伤、创伤恢复、疼痛、癌症、糖尿病等各种疾病，使用SPM是否有治疗效果的研究，正在积极进行中。另一方面，体内炎症反应终止信号物质SPM具有在ω-3多不饱和脂肪酸中插入两个或三个羟基的结构，并且已知通过两种或多种酶的连续作用产生非常痕量的SPM。因此，为了制造对炎症反应终止信号物质的药效和治疗药物充分开发的SPM，一直在努力通过有机合成方法制造(参照非专利文献1)，但存在其方法非常复杂的限制。最近，报道了通过使用大豆15-脂肪氧合酶(15-lipoxygenase)、马铃薯脂肪氧合酶或藻类脂肪氧合酶，可以制备ω-3多不饱和脂肪酸的单羟基(mono-hydroxy)或二羟基(di-hydroxy)衍生物(参见非专利文献2至4)。但是，除了上述酶之外，还在继续研究能够产生SPM的新酶。(现有技术文献)(非专利文献1)Ogawaetal.,J.Org.Chem.,82(4),2032-2039(2017)(非专利文献2)Dobsonetal.,JournalofLipidResearch,54,1439-1447(2013)(非专利文献3)Butovichetal.,Lipids,40(3),249-257(2005)(非专利文献4)Zhuetal.,PLOSONE,10(2),e0117351(2015)
技术实现思路
【技术问题】本专利技术的目的是提供一种能够由多不饱和脂肪酸产生多羟基衍生物的酶，以及使用该酶能够在体内(invivo)或体外(invitro)产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法。【技术方案】为了实现该目的，本专利技术的一个方面提供了一种酶，具有SEQIDNO:1的氨基酸序列，用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物。本专利技术的另一方面提供了一种酶，具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物。本专利技术的另一方面提供了一种体外制备多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法，包括使得用于制备二羟基衍生物的酶、或用于制备三羟基或四羟基衍生物的酶，与多不饱和脂肪酸，例如二十二碳六烯酸反应。本专利技术的另一方面提供了一种在体内生产多羟基衍生物的方法，包括在多不饱和脂肪酸例如二十二碳六烯酸的存在下培养转化体，其转导了编码用于产生二羟基衍生物的酶或用于产生三羟基或四羟基衍生物的酶的基因，以及从培养的培养基中分离多羟基衍生物。【有益效果】根据本专利技术，所述酶可通过使用多不饱和脂肪酸作为底物，在单一反应中产生例如二羟基、三羟基或四羟基的多羟基衍生物，并且可非常有效地用于多羟基衍生物的离体(exvivo)产生。然而，本专利技术的效果不限于上述效果，并且本领域技术人员从以下描述将清楚地理解未提及的其它效果。【附图说明】图1A示出了通过SDS-PAGE确认具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质K9V_A296G过表达的结果，图1B示出通过SDS-PAGE确认具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白质K9V过表达的结果。图2A示出了对通过使具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质K9V_A296G与亚油酸反应获得的反应产物进行正相HPLC分析和手性HPLC分析的结果，图2B示出对具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白质K9V的反应产物进行正相HPLC分析和手性HPLC分析的结果。在图2A和图2B中，分别地，9R-HODE是指9R-羟基十八碳二烯酸(9R-hydroxy-octadecadienoicacid)，而13S-HODE是指13S-羟基十八碳二烯酸(13S-hydroxy-octadecadienoicacid)。图3A示出了通过对由具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应获得的反应产物进行反相HPLC和质谱分析来分析存在于反应产物中的羟基衍生物的结果，而图3B表示通过对由具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应获得的反应产物进行反相HPLC和质谱分析来分析存在于反应产物中的羟基衍生物的结果。图4A和图4B示出了具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应得到的反应产物的NMR分析结果，图4C至图4E显示了具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应得到的反应产物的NMR分析结果。图5A和图5B示出了对具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应获得的反应产物的结果通过NMR分析所确认的衍生物的化学结构，其中图5A示出了由具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质产生的二羟基衍生物的化学结构式，图5B示出了由具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质产生的单羟基衍生物的化学结构式。另外，图5C至图5E说明了具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应获得的反应产物的结果通过NMR分析所确认的衍生物的化学结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的酶，所述酶具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180416 KR 10-2018-0043972;20180504 KR 10-2018-001.一种用于产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的酶，所述酶具有SEQIDNO:1的氨基酸序列或SEQIDNO:2的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的用于产生多不饱和脂肪酸的所述多羟基衍生物的酶，其中具有所述SEQIDNO:1的氨基酸序列，所述多羟基衍生物为二羟基衍生物。


3.如权利要求1所述的用于产生多不饱和脂肪酸的所述多羟基衍生物的酶，其中具有所述SEQIDNO:2的氨基酸序列，所述多羟基衍生物为三羟基或四羟基衍生物。


4.如权利要求1至3中任一项所述的用于产生多不饱和脂肪酸的所述多羟基衍生物的酶，其中所述酶的底物为二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸。


5.一种基因，其编码权利要求1所述的用于产生多不饱和脂肪酸的所述多羟基衍生物的酶。


6.如权利要求5所述的基因，其中所述基因由SEQIDNO:3的核苷酸序列或SEQIDNO:4的核苷酸序列组成。


7.一种重组表达载体，其包含权利要求5的基因。


8.一种转化体，其将权利要求7的所述重组表达载体导入宿主细胞。


9.一种在体外产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法，包括使权利要求1的所述酶与多不饱和脂肪酸反应。


10.如权利要求9所述的体外生产多不饱和脂肪酸的所述多羟基衍生物的方法，还包括：
从所述酶和所述多不饱和脂肪酸的反应产物回收多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物或多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物。...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐正又，李宗载，许仙宴，金荣培，金哲镐，吴百禄，朱政炫，崔学善，
申请(专利权)人：韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：韩国;KR