一种海藻糖合成酶基因优化序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种海藻糖合成酶基因优化序列，包含如SEQ ID No.1所示的DNA序列。所述海藻糖合成酶基因优化序列表达的氨基酸包含如SEQ ID No.2所示的序列。本发明专利技术的海藻糖合成酶基因优化序列，通过密码子优化，在不改变最终氨基酸序列的基础上，将灰色链霉菌来源海藻糖合成酶基因序列中大肠杆菌稀有密码子或低频密码子均进行合理优化，突破了异源基因在大肠杆菌中的基因翻译瓶颈，提高了基因翻译效率，实现了在大肠杆菌中高产量可溶性表达，解决了大肠杆菌异源表达效率低的问题，大大降低海藻糖合成酶的生产成本。本发明专利技术可提高海藻糖合成酶的工业产值，降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种海藻糖合成酶基因优化序列及其应用
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种海藻糖合成酶基因优化序列及其制作方法和应用。
技术介绍
海藻糖合成酶(TrehaloseSynthase)通过分子内转苷作用，可催化麦芽糖中两个葡萄糖分子α,α-1,4-糖苷键转变成葡萄糖α,α-1,1-糖苷键，从而生成海藻糖。已报道利用生物酶法合成海藻糖存在TPS/TPP、TS、TreY/TreZ、TreP、TreT等5种途径。其中海藻糖合成酶途径(TS途径，又称Tres途径)仅需一种酶一步酶反应，在海藻糖的工业化生产中，相比传统酵母细胞提取法及其他生物合成途径具有底物廉价、工艺简单、易于调控等显著优点，是生物酶法工业化合成海藻糖研究的热点。来源于灰色链霉菌Streptomycesgriseussubsp.Griseus的海藻糖合成酶转化效率高、反应速度快，葡萄糖副产物少。但该酶在天然的灰色链霉菌中属于胞内酶，表达量极低，需浓缩上千倍才能检测到海藻糖合成酶活性（一种灰色链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用，CN102533801A）。大肠杆菌(Escherichiacoli)繁殖迅速、培养简单、遗传背景清楚、表达系统成熟，利用基因工程法构建大肠杆菌工程菌株来表达灰色链霉菌海藻糖合成酶，有望解决这一问题。外源蛋白在大肠杆菌中的表达差异，除受表达条件的直观影响外，外源基因自身特性的影响也至关重要。其中密码子的选择是左右表达量的参数之一，基因表达水平高低与嗜好密码子的使用程度之间存在较强的相关性。密码子适应指数（CodonAdaptionIndex，CAI）反映基因编码区所有同义密码子中某一指定密码子的使用频率与最优密码子频率相符合的程度。取值范围在0-1之间，表达量较高的基因常具有较高的CAI值，表达量较低的基因则具有较低的CAI值，一般建议高表达优化CAI取值0.8-1.0范围。密码子使用频率分布（CondonFrequencyDistribution，CFD），如基因序列出现有使用频率小于30%的密码子，存在阻碍基因高效表达可能性。GC含量是鸟嘌呤和胞嘧啶所占DNA4种碱基的比率。GC含量随DNA来源物种不同而异。GC含量高低影响DNA的密度，GC含量高，相应DNA密度也高，加热及加碱均不易使之变性，GC含量理想的比例范围是30%-70%。灰色链霉菌密码子偏好性与大肠杆菌存在着很大差别，因此来源于灰色链霉菌的海藻糖合成酶的基因在大肠杆菌中的表达量低，工业上急需能够在大肠杆菌中高表达的新海藻糖合成酶基因。
技术实现思路
针对灰色链霉菌中海藻糖合成酶含量低，来源于灰色链霉菌的海藻糖合成酶的基因在大肠杆菌中的表达效率低的问题，本专利技术提供一种在大肠杆菌中高可溶性表达的海藻糖合成酶基因优化序列。本专利技术的另一目的是提供一种含有上述海藻糖合成酶基因优化序列的表达载体。本专利技术的再一目的是一种含有上述海藻糖合成酶基因优化序列的大肠杆菌基因工程菌株。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种海藻糖合成酶基因优化序列，包含如SEQIDNo.1所示的DNA序列。所述海藻糖合成酶基因优化序列的两端还包括至少一对核酸内切酶酶切位点；优选为NcoI酶和XhoI酶。所述海藻糖合成酶基因优化序列表达的氨基酸包含如SEQIDNo.2所示的序列。一种含有上述海藻糖合成酶基因优化序列的重组表达载体。所述重组表达载体的质粒含有信号肽的编码基因。所述信号肽优选为pelB信号肽。所述重组表达载体的质粒选自pET-20b(+)、pET-22b(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)或pET-27b(+)。一种含有上述海藻糖合成酶基因优化序列或表达载体的大肠杆菌基因工程菌株。所述大肠杆菌宿主菌选自BL21(DE3)、BLR(DE3)、BL21-Gold(DE3)、Tuner(DE3)、HMS174(DE3)、C43(DE3)、NovaBlue(DE3)或Rosettagammi(DE3)菌株。一种上述海藻糖合成酶基因优化序列、重组表达载体或大肠杆菌基因工程菌株在生产灰色链霉菌来源海藻糖合成酶中的应用。一种采用上述海藻糖合成酶基因优化序列、重组表达载体或大肠杆菌基因工程菌株生产灰色链霉菌来源海藻糖合成酶的方法，包括以下步骤：（1）以IPTG为诱导剂，诱导培养含有海藻糖合成酶基因优化序列的重组表达载体的大肠杆菌基因工程菌株；（2）收集诱导培养后的菌体，然后裂解菌体、分离纯化获得灰色链霉菌来源海藻糖合成酶。步骤（1）中，所述IPTG的终浓度为0.2-1mM；诱导时间为4-20h；诱导时的菌悬液OD600为0.8-1.0。本专利技术具有以下优点：本专利技术的海藻糖合成酶基因优化序列，通过密码子优化，在不改变最终氨基酸序列的基础上，将灰色链霉菌来源海藻糖合成酶基因序列中大肠杆菌稀有密码子或低频密码子均进行合理优化，突破了异源基因在大肠杆菌中的基因翻译瓶颈，提高了基因翻译效率，实现了在大肠杆菌中高产量可溶性表达，解决了大肠杆菌异源表达效率低的问题，大大降低海藻糖合成酶的生产成本。本专利技术可提高海藻糖合成酶的工业产值，降低生产成本，为企业带来较高经济效益。附图说明图1为重组表达载体pET-26b(+)-tres1双酶切后电泳图；图2为重组菌株BL21/pET-26b(+)-tres1与BL21/pET-26b(+)-tres粗酶液SDS-PAGE电泳图片；图3为重组菌株BL21/pET-26b(+)-tres1与BL21/pET-26b(+)-tres粗酶液酶活比较。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1重组表达载体pET-26b(+)-tres1的构建与鉴定。以GeneBank中序列号为HQ915641.1的灰色链霉菌海藻糖合成酶（tres）的序列（SEQIDNo.3）为参照，根据密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成的基础上，优选大肠杆菌的高频或次高频密码子，对其序列进行改造，将大肠杆菌的某些稀有密码子替换为大肠杆菌偏爱密码子，最后得到的优化后的海藻糖合成酶基因优化序列如SEQIDNO.1所示；其CAI为0.97，GC含量为54.4%，CFD>50%。海藻糖合成酶基因优化序列（tres1）5’端加上NcoI酶切位点（CCATGG），3’端加上XhoI酶切位点（CTCGAG），进行全基因合成。将海藻糖合成酶基因优化序列双酶切后连接同样双酶切后的pET-26b(+)质粒(Novagen公司)。将连接产物以热激法转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃培养。挑取单菌落，在含有卡那霉素的LB培养基中培养，碱裂解法提取质粒，经PCR扩增和NcoII、XhoI双酶切鉴定，阳性质粒获得目的条带，如图1（泳道1为阳性质粒，泳道2为NcoI、XhoI双酶切后的阳性质粒，泳道M为Maker）所示：阳性质粒双酶切后1.5-2kb之间有目的基因条带；将阳性质粒进行测序，测序结果证明优化后的海藻糖合成酶基因已经成功插入到pET-26b(+)质粒中，没有点突变，原核表达载体构建成功，将测序正确的重组载体命名为pET-26b(+)-tres1。以GeneBank中序列号为HQ915641.1的灰色链霉菌海藻糖合成酶（tre本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海藻糖合成酶基因优化序列，其特征在于，包含如SEQ ID No.1所示的DNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种海藻糖合成酶基因优化序列，其特征在于，包含如SEQIDNo.1所示的DNA序列。2.根据权利要求1所述的海藻糖合成酶基因优化序列，其特征在于，两端还包括至少一对核酸内切酶酶切位点；优选为NcoI酶和XhoI酶。3.根据权利要求1所述的海藻糖合成酶基因优化序列，其特征在于，表达的氨基酸包含如SEQIDNo.2所示的序列。4.一种含有如权利要求1所述的海藻糖合成酶基因优化序列的重组表达载体；优选的，重组表达载体含有信号肽的编码基因；所述信号肽优选为pelB信号肽。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的质粒选自pET-20b(+)、pET-22b(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)或pET-27b(+)。6.一种含有如权利要求1所述的海藻糖合成酶基因优化序列或如权利要求4所述的重组表达载体的大肠杆菌基因工程菌株。7.根据权利要求6所述的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌株的宿主菌选自BL21(...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓元，刘飞，郝荣华，袁丹丹，陈勉，凌沛学，张辉，解荣利，王羽，高亮，
申请(专利权)人：山东省药学科学院，
类型：发明
国别省市：山东,37