本发明专利技术公开了一种甘蓝型油菜BnKCS1‑2基因及其构建的载体和应用，本发明专利技术克隆了甘蓝型油菜蜡质合成前体物质超长链脂肪酸形成的关键酶基因BnKCS1‑2，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。转入了BnKCS1‑2基因的油菜植株叶片蜡质含量增加，利用BnKCS1‑2基因的过量表达促进植物表皮蜡合成时，可用于发展生物燃料。而且转BnKCS1‑2基因的油菜叶片蜡质含量与组份的变化使植株抗逆性得到增强，这为提高植物抗逆性提供了新的有效选择和可行方法。
【技术实现步骤摘要】
一种甘蓝型油菜BnKCS1-2基因及其构建的载体和应用
本专利技术属于油菜基因应用
，涉及一种甘蓝型油菜BnKCS1-2基因及其构建的载体和应用。
技术介绍
化石燃料是世界一次能源的主要部分。地球上的化石燃料十分有限，且短时间内不能自然再生，因此潜在着化石燃料能源短缺的危机。同时，人类不断地燃烧化石燃料而排放二氧化碳，这也是加快全球变暖的因素之一。如何解决人类面临的能源短缺问题以及减少化石燃料对环境的影响，将是摆在人类面前的一个重大问题。为解决这个问题，在有可能的情况下多使用可再生能源，如生物能等，这可以帮助增加全球的能源所需。此外，生物燃料中的二氧化碳成份来自大气层，因此发展生物燃料可以减少在大气层上的二氧化碳，从而减低温室效应。油菜是我国重要的油料作物之一，经济价值高。油菜籽油除了用于食用油之外，还可以作为生物柴油的生产原料来替代化石燃料。然而，油菜在生长的过程中常会遇到一些影响产量的不利环境因素，如干旱、低温、渍水等。这些外界因素很难克服，易造成油菜严重倒伏，菌核病大量发生。因此，筛选出耐旱、抗病、抗倒伏的基因性品种，对于实现油菜高产稳产具有重要意义。植物对逆境胁迫能够产生一定的响应，当外界环境的刺激传递到植物体后，其体内会产生一系列响应信号，以调节其对环境胁迫因子的适应性。例如，气孔关闭和渗透系数的调节等。随着分子生物学的发展，我国油菜抗逆性研究方向不再只停留在传统育种的研究层面上，研究者们开始探索用基因工程手段选育新型高抗或多抗植物品种。植物表皮蜡质覆盖在植物地上部分的表面，是植物与外界环境的第一层屏障，疏水的蜡质层可防止植物体内水分丧失、表面防水、减少短波辐射以及保护叶片免受积聚灰尘和菌类致死孢子的影响。植物表面蜡质主要是一类脂肪族化合物、环状化合物以及甾醇类化合物的有机混合物总称。因此高蜡质植物也可作为生物能源材料之一。到目前为止，关于表皮蜡质对甘蓝型油菜抗逆机制的贡献还不明确，也没有任何通过转基因分子育种创造高蜡质甘蓝型油菜的报道。KCS基因家族是拟南芥中的第二大基因家族，有21个成员，编码β-酮脂酰-CoA缩合酶，是超长链脂肪酸生物合成过程中的限速酶。此前已在拟南芥中探明FAE1(KCS18)基因调控芥酸的合成，KCS6基因参与拟南芥蜡质的合成，拟南芥KCS1突变体蜡质组份中一级醇、醛类含量减少。甘蓝型油菜中KCS基因家族可能至少有46个成员，目前只对KCS18基因进行了较深入系统的研究。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种甘蓝型油菜BnKCS1-2基因及其构建的载体和应用，BnKCS1-2基因能够提高植物角质层蜡质含量和抗逆性。本专利技术是通过以下技术方案来实现：一种甘蓝型油菜BnKCS1-2基因，该基因是甘蓝型油菜超长链脂肪酸形成的关键酶基因：β-酮脂酰-CoA合酶基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。一种甘蓝型油菜BnKCS1-2基因构建的载体，是将SEQ.ID.NO.1所示的BnKCS1-2基因克隆入植物表达载体的多克隆位点。进一步的，该载体为pCambia-35S-BnKCS1-2表达载体，通过BamHI和SacI酶切位点将BnKCS1-2基因克隆入植物表达载体pCambia2301M1DPB。一种基于BnKCS1-2基因过表达的转基因甘蓝型油菜的制备方法，包括以下操作：1)通过BamHI和SacI酶切位点将BnKCS1-2基因克隆入植物表达载体pCambia2301M1DPB，构建pCambia-35S-BnKCS1-2表达载体；2)将构建好的植物超表达载体pCambia-35S-BnKCS1-2导入农杆菌；3)然后利用农杆菌介导的下胚轴转化方法导入油菜：将无菌的油菜苗下胚轴切成小段，均匀的接种于MSp培养基，28℃光照培养2-3天进行预培养；将预培养的下胚轴浸入OD600为0.4左右的重悬农杆菌菌液中5-8min，之后除去多余的农杆菌菌液，将下胚轴接种于MSc培养基上，28℃黑暗培养48小时，之后接种于MSi培养基上，28℃下光照培养14天左右，至外植体两端长出明显抗性愈伤为止；将长有抗性愈伤的外植体接种于MSd培养基上，28℃下光照培养，15天左右更换一次MSd培养基，直至抗性愈伤分化出芽为止；将分化出芽的外植体转接于MSe培养基上，28℃下光照培养，至长出茎及叶片；把长出发达的茎和叶的幼苗移至MSr培养基上，28℃下光照培养，至长出发达根部为止；MSr培养基中茎、叶、根都生长正常的幼苗，敞开培养罐，在培养间生长2-3天，然后移入0.1MS液体培养基，待其长至5-6位叶。所述的甘蓝型油菜BnKCS1-2基因在制备表皮蜡含量增加的转基因油菜中的应用。所述的甘蓝型油菜BnKCS1-2基因在提高植物抗逆性中的应用。所述应用是将甘蓝型油菜BnKCS1-2基因转染到油菜中使其过表达，改变油菜叶片蜡质含量的变化，提高油菜的抗旱性、抗病性。所述的甘蓝型油菜BnKCS1-2基因在制备用于生物燃料的转基因甘蓝型油菜中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术提供的甘蓝型油菜BnKCS1-2基因，是克隆自甘蓝型油菜的β-酮脂酰-CoA合酶基因KCS1，其核苷酸序列长度为1587bp；该基因主要在甘蓝型油菜地上部分器官茎、叶、花、角果中表达，在叶片中的表达量最高，这与蜡质在油菜地上部各组织器官的分布特征相一致，表明这个基因可能参与了甘蓝型油菜地上部分各组织器官的角质层蜡质的合成；BnKCS1-2在有蜡粉材料的茎和叶中的表达量均显著高于无蜡粉材料，表明BnKCS1-2的转录水平与蜡质合成密切相关。本专利技术利用甘蓝型油菜BnKCS1-2基因构建植物表达载体pCambia-35S-BnKCS1-2，导入农杆菌LBA4404菌株，然后利用农杆菌介导的下胚轴转化方法导入油菜，经过对重组后的植株进行检测，实验证明转入了BnKCS1-2基因的油菜植株叶片蜡质总量显著增加，蜡质组份中，酸类、一级醇类、醛类、烷类、次级醇类、以及酮类也显著增加。因此利用BnKCS1-2基因的过量表达促进植物表皮蜡合成时，可用于发展生物燃料。本专利技术实验结果还表明，转BnKCS1-2基因的油菜叶片蜡质含量与组份的变化使得植株抗逆性得到增强，这为提高植物抗逆性提供了新的有效选择和可行方法，具有良好的应用前景。因此，甘蓝型油菜BnKCS1-2基因在提高植物角质层蜡质含量与抗逆性具有良好的利用前景。附图说明图1为BnKCS1-2在甘蓝型油菜不同组织器官中的表达模式图。图2为BnKCS1-2基因在有蜡粉材料中双11与无蜡粉材料NoWax茎、叶中的差异表达模式图。图3为植物过表达载体结构图。其中，A为pCambia2301M1DPB载体示意图；B为pCambia-35S-BnKCS1-2载体示意图。图4为BnKCS1-2转基因油菜的PCR鉴定结果示意图。其中，1为空白对照；2为阴性对照；3为阳性对照；4-22为再生植株的检测条带。图5为BnKCS1-2转基因油菜的GUS染色鉴定图。图6为BnKCS1-2基因过表达与对照植株基因定量分析。图7为BnKCS1-2基因过表达与对照植株叶片表皮蜡质沉积分析。图8为BnKCS1-2基因过表达油菜植株与对照植株在干旱胁迫处理后的比较示意图。图9为BnKCS1-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种甘蓝型油菜BnKCS1‑2基因，其特征在于，该基因是甘蓝型油菜超长链脂肪酸形成的关键酶基因：β‑酮脂酰‑CoA合酶基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种甘蓝型油菜BnKCS1-2基因，其特征在于，该基因是甘蓝型油菜超长链脂肪酸形成的关键酶基因：β-酮脂酰-CoA合酶基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。2.一种甘蓝型油菜BnKCS1-2基因构建的载体，其特征在于，是将SEQ.ID.NO.1所示的BnKCS1-2基因克隆入植物表达载体的多克隆位点。3.如权利要求2所述的甘蓝型油菜BnKCS1-2基因构建的载体，其特征在于，该载体为pCambia-35S-BnKCS1-2表达载体，通过BamHI和SacI酶切位点将BnKCS1-2基因克隆入植物表达载体pCambia2301M1DPB。4.一种基于BnKCS1-2基因过表达的转基因甘蓝型油菜的制备方法，其特征在于，包括以下操作：1)通过BamHI和SacI酶切位点将BnKCS1-2基因克隆入植物表达载体pCambia2301M1DPB，构建pCambia-35S-BnKCS1-2表达载体；2)将构建好的植物超表达载体pCambia-35S-BnKCS1-2导入农杆菌；3)然后利用农杆菌介导的下胚轴转化方法导入油菜：将无菌的油菜苗下胚轴切成小段，均匀的接种于MSp培养基，28℃光照培养2-3天进行预培养；将预培养的下胚...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪郁，李帅，张双娟，徐熠，王艳枚，靳舒荣，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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