用于海关的快速鉴定方法技术

本申请涉及一种用于海关的快速鉴定方法，属于包含酶或微生物的测定或检测方法技术领域。取样品组织，纯化DNA；设计上、下引物序列，上游引物:5’CTTACCTGGGGGCACTGTA3’，下游引物:5’GCTCCCGAGTGGGCTCAC3’；以纯化得到的DNA为模板，结合上、下引物实施qPCR，qPCR的反应程序包括40个循环，每个循环为：95℃/3″，60℃/10″72℃/10″，对合成产物再次测序和确认比较，即可确认其是否为设定肉源。将本申请应用于虎肉等设定肉源的鉴定，具有操作简便、获取率高、成本低廉等优点。

【技术实现步骤摘要】
用于海关的快速鉴定方法
本申请涉及一种用于海关的快速鉴定方法，属于包含酶或微生物的测定或检测方法

技术介绍
虎(Pantheratigris)属于动物界(Animalia)、脊索动物门(Chordata)、脊椎动物亚门(Vertebrata)、哺乳纲(Mammalia)、食肉目(arnivora)、猫科(Felidae)、豹属(Panthera)，共有8个亚种：①孟加拉虎，分布于印支半岛；②西亚虎，又称里海虎，分布于土耳其、亚洲中部及西部；③东北虎，又称西伯利亚虎，分布于中苏边境的黑龙江及朝鲜一带；④爪哇虎，分布于印尼爪哇；⑤华南虎，又称厦门虎/南中国虎，分布于华中地区的南部；⑥巴厘虎，分布于印尼巴厘岛；⑦苏门答腊虎，分布于印尼苏门答腊；⑧东南亚虎，又称印支虎，分布于东南亚大陆地区。据2009年3月网上的数据，西亚虎、爪哇虎和巴厘虎三个亚种已灭绝，现存的5个亚种中，孟加拉虎约有3,060至4,735头，东北虎437至506头，华南虎20至30头，苏门答腊虎400至500头，东南亚虎1,180至1,790头。目前认为华南虎已在自然界中灭绝，仅在几个有限的动物园中圈养供游客观赏。可见虎在自然界中数量稀少，应采取积极果断的措施加以保护。尽管如此，野生动物捕猎和走私活动在世界范围内仍然存在，严重威胁野生动物的生存。为了更好地打击野生动物在世界范围内的交易，有必要确立适用于执法部门操作的有效方法，特别是如何实现快速有效的检测并鉴定野生动物来源，然而，国际间的执法与监管难度以及现有技术上的漫长周期检测，让保护力量显得过于苍白。华南虎(PantheratigrisAmoyensis)是我国特有的虎的亚种，于1981年被列入CITES公约附录Ⅰ保护名单，亦称“中国虎”，目前认为已在自然界中灭绝，仅在几个有限的动物园中圈养供游客观赏。世界上有很多此类的濒危动物。随着组学研究技术的发展，获取任何生物的DNA信息并非难事，只是成本太高，在没有一定前期工作基础的情况下，难以获得任何级别的经费支持。因此，如何在经费有限的情况下获得一些DNA信息并开展一些工作，为今后争取国家经费做好前期工作，打下良好基础就显得尤为重要。基于此，做出本申请。
技术实现思路
针对现有珍稀动物DNA获取所存在的上述缺陷，本申请提供一种操作便捷、获取率高、成本低廉的用于海关的快速鉴定方法。为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：用于海关的快速鉴定方法，包括以下步骤：(1)取样品组织，纯化DNA；(2)设计上、下引物序列，上游引物:5’CTTACCTGGGGGCACTGTA3’，下游引物:5’GCTCCCGAGTGGGCTCAC3’；(3)以步骤(1)中纯化得到的DNA为模板，以步骤(2)中得到的上、下引物实施qPCR，qPCR的反应程序包括40个循环，每个循环为：95℃/3″，60℃/10″72℃/10″，对合成产物再次测序和确认比较，并与步骤(1)和步骤(2)中的序列进行比较，即可确认其是否为设定肉源。进一步的，作为优选：步骤(1)中，所述纯化采用酚氯仿提取法纯化，将样品组织进行裂解后，离心取上清，上清中加入Tris-饱和酚；取上层水相，加酚氯仿混合液，混匀常温离心；取上层水相，加氯仿，混匀常温离心；取上层水相，加预冷异丙醇，混匀4℃离心；去上清，白色沉淀中加预冷70％乙醇，4℃离心；去上清，吸除70％乙醇，即得纯化DNA。步骤(1)中，所述纯化采用以下步骤进行：①裂解匀浆：配制裂解液，将待检测组织置于裂解液中静置裂解，裂解温度37℃，裂解时间10-20min，②DNA结合柱结合：将裂解产物与DNA结合柱上，借助于DNA结合柱表面偶联的带正电荷二乙胺乙醇亲水性树脂与带负电的DNA磷酸基的作用进行结合，③将完成结合的DNA结合柱置于灭菌水中，常温离心脱下，即为纯化DNA。所述裂解液中包含有蛋白酶K和RNaseA，蛋白酶K在裂解液中的浓度为20μg/mL，RNase在裂解液中的浓度为10μg/mL。更优选的，所述裂解液的构成为：150mMNaCl；10mMTris-HCl，pH8.0；10mMEDTA；0.1％SDS；20μg/mL蛋白酶K；10μg/mLRNaseA。步骤(3)中，所述的确认比较采用溶解曲线做对比，溶解曲线以65-95℃作为实验区间，每5℃设置5″以获得溶解曲线。步骤(3)中，所述qPCR的反应体系：KapaFastqPCRMaterMix5μL。本申请的工作原理和有益效果分析如下：(1)快速纯化动物DNA阶段，我们不仅实现了DNA的快速纯化，还实现了经济又快速获得动物大量基因片段的方法。在此过程中，团队成功克隆多个华南虎的基因片段，并根据与DNA数据库中的数据比对结果，设计多对引物，发现其中部分引物只能在华南虎的模板中获得清晰的PCR产物，通过严密的实验设计和实施，确定了有两组引物可用于虎肉、虎毛等虎源组织的鉴定。该检测方法从收到检测样品开始，只需要2.5个小时即可完成鉴定，是至今为止最为快速的检测方法。该方法可实现快速有效检测平台的搭建，并可立即用于虎源组织鉴定的实际和生产，为海关执法、鉴别野生动物来源、对野生动物进行更好的保护等提供了有利的技术支撑。(2)本申请对不同处理温度和时间进行实验，DNA浓度检测和qPCR检测结果表明，获得的总DNA的总量没有显著差异，线粒体DNA的浓度也无统计学上的差异。该实验重复多次，在所测试的样品中均十分成功，再现性良好。这个实验表明将动物组织研磨匀浆并进行37℃进行较短时间处理即可进行抽提DNA，完成该实验的时间较短，再加上PCR的80min，动物肉源性鉴定可在3.5h内完成。(3)通过酚/氯仿抽提法，纯化动物组织DNA在2h内完成。而本申请在进行纯化DNA时，纯化柱表面偶联有带正电荷的二乙胺乙醇(DEAE)亲水性树脂，DNA磷酸基带负电荷，因此DNA可以结合到纯化柱上。我们在进行对比实验时，使用酚/氯仿抽提法和DNA纯化柱对动物组织线粒体DNA分别进行纯化，DNA浓度检测表明两种方法获得的DNA浓度差别很大，但是qPCR检测结果表明，两种方法获得的DNA中线粒体DNA的浓度无统计学上的差异。这个实验表明，将组织研磨匀浆并进行37℃/10min处理后，通过DNA凝胶回收试剂盒中的BufferG、WS和WG以及该公司质粒回收试剂盒中的DNA结合柱，可实现快速高效地获得动物动物组织线粒体DNA，全过程仅需35min，加上PCR80min，动物肉源性鉴定在约2h内完成。因此，将动物组织前处理的样品使用DNA纯化柱进行纯化，并去除大部分核DNA，一方面可以缩短DNA纯化的时间，另一方面，也可以避免使用具有强烈腐蚀性和致癌性的化学试剂——苯酚和氯仿，减少了此类废液的产生。附图说明图1为本申请方案下不同物种的扩增曲线图(图中，A为虎肉，B为牛肉，C为羊肉)；图2为本申请方案下不同物种的溶解曲线图(图中，A为虎肉，B为牛肉，C为羊肉)；图3为本申请方案下不同物种的电泳图(图中，1-3为虎肉，4-6为牛肉；7-9为羊肉)。具体实施方式以下以虎肉的鉴定作为案例，进行本申请技术方案的说明。①获得华南虎的组织后，通过苯酚/氯仿抽提法纯化DNA，作为样品检测的模板(浓度为20ng/L)。②上游引物F本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于海关的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：取样品组织，纯化DNA；(2)设计上、下引物序列，上游引物:5’CTTACCTGGGGGCACTGTA3’，下游引物:5’GCTCCCGAGTGGGCTCAC3’；(3)以步骤(1)中纯化得到的DNA为模板，以步骤(2)中得到的上、下引物实施qPCR，qPCR的反应程序包括40个循环，每个循环为：95℃/3″，60℃/10″72℃/10″，对合成产物再次测序和确认比较，即可确认其是否为设定肉源。

【技术特征摘要】
1.用于海关的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：取样品组织，纯化DNA；(2)设计上、下引物序列，上游引物:5’CTTACCTGGGGGCACTGTA3’，下游引物:5’GCTCCCGAGTGGGCTCAC3’；(3)以步骤(1)中纯化得到的DNA为模板，以步骤(2)中得到的上、下引物实施qPCR，qPCR的反应程序包括40个循环，每个循环为：95℃/3″，60℃/10″72℃/10″，对合成产物再次测序和确认比较，即可确认其是否为设定肉源。2.如权利要求1所述的用于海关的快速鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述纯化采用酚氯仿提取法纯化，将样品组织进行裂解后，离心取上清，上清中加入Tris-饱和酚；取上层水相，加酚氯仿混合液，混匀常温离心；取上层水相，加氯仿，混匀常温离心；取上层水相，加预冷异丙醇，混匀4℃离心；去上清，白色沉淀中加预冷70％乙醇，4℃离心；去上清，吸除70％乙醇，即得纯化DNA。3.如权利要求1所述的用于海关的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述纯化采用以下步骤进行：①裂解匀浆：配制裂解液，将待检测组织置于裂解液中静置裂解...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨仙玉，张先福，马敬华，施伟斌，刘建勋，
申请(专利权)人：浙江农林大学，杭州野生动物世界有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33