使用FOXB2基因的癌细胞的判定方法技术

本发明专利技术的课题在于，提供一种能够简单地判定癌细胞的方法。本发明专利技术涉及“癌细胞的判定方法，其中，其包括下述工序1～3，(1)工序1，使至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的来自细胞的核酸进行亚硫酸氢盐反应；(2)工序2，对通过工序1得到的反应产物中的至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号1所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物进行扩增；以及(3)工序3，基于使通过工序2得到的扩增产物进行电泳的结果，判定该细胞是否为癌细胞”、“引物组，其中，其由序列号6所示的碱基序列构成的正向引物、以及由序列号8的一部分或全部构成且至少包含序列号7所示的碱基序列的碱基序列构成的反向引物或者由序列号9所示的碱基序列构成的反向引物构成”、以及“细胞的癌判定用试剂，其中，其包含前述引物组”。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用FOXB2基因的癌细胞的判定方法
本专利技术涉及一种使用FOXB2基因的癌细胞的判定方法。
技术介绍
将一类具有叉头或翼状螺旋DNA结合域的转录因子称为叉头框(Forkheadbox，FOX)，在人体中存在约50种。FOX主要作为生长调节因子、组织特异性调节因子、细胞周期调节因子发挥作用，但是，许多FOX的作用几乎尚未阐明。其中，已报告了FOXB2在非洲爪蟾中参与形成胚胎神经，然而，其在哺乳动物中的功能还尚未明确。另一方面，已知DNA的甲基化与癌变有关，在日本特开2008-283947(专利文献1)中，记载有一种基于FOXB2基因的CpG岛(CpG二核苷酸：-CG-序列)中的甲基化率检测食道癌的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2008-283947。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题在上述专利文献1中，记载了癌细胞的CpG二核苷酸的胞嘧啶大多发生甲基化，而且，还记载了采用BAMCA法(BacterialArtificialchromosomearray-basedMethylatedCpGislandAmplification，细菌人工染色体的甲基化CpG岛扩增阵列法)测定食道癌的FOXB2基因并确认了CpG二核苷酸的胞嘧啶被甲基化。然而，为了通过该方法判定是否为癌细胞，需要解读碱基序列来确认CpG二核苷酸的胞嘧啶是否被甲基化。因此，期待一种简单地判定细胞是否为癌细胞的方法。即，本专利技术的课题在于，提供一种能够简单地判定癌细胞的方法。用于解决课题的手段本专利技术人等对作为容易辨别癌细胞和正常细胞的方法的亚硫酸氢盐反应产物的检测方法进行了专心研究，其结果发现了：对包含亚硫酸氢盐反应后的FOXB2基因的启动子区域中特定的碱基序列的核酸进行扩增并进行电泳，从而能够将来自癌细胞的扩增产物和来自正常细胞的扩增产物分离。对于进行亚硫酸氢盐反应后扩增的碱基序列而言，癌细胞和正常细胞均为相同的长度，因此，可以认为，难以通过电泳将这些细胞的扩增产物分离。但是，意想不到地发现对包含特定的碱基序列的核酸进行扩增时，能够将来自癌细胞的扩增产物和来自正常细胞的扩增产物分离，从而本专利技术人等完成了本专利技术。即，本专利技术涉及下述内容。“癌细胞的判定方法，其中，其包括下述工序1～3，(1)工序1，使至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的来自细胞的核酸进行亚硫酸氢盐反应；(2)工序2，对通过工序1得到的反应产物中的至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号1所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物进行扩增；以及(3)工序3，基于使通过工序2得到的扩增产物进行电泳的结果，判定该细胞是否为癌细胞”；“引物组，其中，其由序列号6所示的碱基序列构成的正向引物、以及由序列号8的一部分或全部构成且至少包含序列号7所示的碱基序列的碱基序列构成的反向引物或者由序列号9所示的碱基序列构成的反向引物构成”；以及“细胞的癌判定用试剂，其中，其包含前述引物组”。专利技术的效果根据本专利技术的方法，不需要像以往方法那样对碱基序列进行解读，在不进行限制性酶处理等的情况下，对由亚硫酸氢盐反应产物的特定碱基序列构成的核酸进行扩增，并使得到的扩增产物进行电泳，从而能够判定目标细胞是否为癌细胞。即，能够通过非常简单的方法在短时间内判定目标细胞是否为癌细胞。另外，由于不需要对碱基序列进行解读、不需要进行限制性酶处理等，因此，也具有能够削减这些步骤所需要的成本、工夫的优点。进一步地，本专利技术的方法还能够判定良性肿瘤为非癌细胞，能够以高精度判定癌。附图的简单说明图1示出了在实施例1中使用hiPS(人正常皮肤成纤维细胞)的正常细胞和人胶质瘤细胞(U251-MG-P1)的癌细胞通过本专利技术的方法对PCR扩增产物进行电泳的结果。图2示出了在实验例1中使用hiPS的正常细胞和U251-MG-P1的癌细胞对胞嘧啶的甲基化进行分析的结果。图3示出了在实施例2中对使用hiPS的正常细胞和U251-MG-P1的癌细胞的FOXB2启动子区域的质粒得到的PCR扩增产物进行电泳的结果、以及在比较例1中使用hiPS的正常细胞和人胶质瘤细胞(U251-MG-P1)的癌细胞对FOXB1基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。图4示出了在比较例2中使用hiPS的正常细胞和U251-MG-P1的癌细胞对FOXB2基因的扩增序列1进行电泳的结果。图5示出了在比较例2中使用hiPS的正常细胞和U251-MG-P1的癌细胞对FOXB2基因的扩增序列2进行电泳的结果。图6示出了在比较例2中使用hiPS的正常细胞和U251-MG-P1的癌细胞对FOXB2基因的扩增序列3进行电泳的结果。图7-1示出了在实施例3中使用来自乳癌患者的细胞(正常组织、肿瘤、淋巴结)对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。图7-2示出了在实施例3中使用来自乳癌患者的细胞(正常组织、肿瘤、淋巴结)对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。图7-3示出了在实施例3中使用来自乳癌患者的细胞(正常组织、肿瘤、淋巴结)对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。图8-1示出了在实施例4中使用来自大肠癌患者的细胞(正常组织、肿瘤)对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。图8-2示出了在实施例4中使用来自大肠癌患者的细胞(正常组织、肿瘤)对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。具体实施方式[本专利技术的癌细胞的判定方法]本专利技术的癌细胞的判定方法(以下，有时简称为本专利技术的方法)由以下工序组成：(1)工序1，使至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的来自细胞的核酸进行亚硫酸氢盐反应；(2)工序2，对通过工序1得到的反应产物中的至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号1所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物进行扩增；以及(3)工序3，基于使通过工序2得到的扩增产物进行电泳的结果，判定该细胞是否为癌细胞。[工序1]只要工序1中的核酸是至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的核酸且来自细胞即可。对于该细胞而言，根据待判定的癌选择该细胞的种类，例如，可举出来自肾脏、子宫、肝脏、乳腺、卵巢、大肠(结肠、直肠)、前列腺、肺、胰腺等上皮细胞的细胞；中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等白细胞；骨髄细胞、T细胞等来自造血器官的细胞；来自肉瘤等非上皮性细胞的细胞；神经母细胞等来自神经的细胞等，优选来自上皮细胞的细胞，其中，优选来自乳腺、肺、大肠等上皮细胞的细胞。另外，对于该细胞而言，优选来自哺乳动物的细胞，特别优选来自人的细胞。另外，对于该细胞而言，能够通过自身公知的方法从血液(全血、血清和血浆)、淋巴液、尿、乳头分泌物、粪便等体液、组织、细胞等生物体试样、这些试样的培养物等试样中获取。对于工序1中的核酸而言，只要从上述细胞中提取即可，该提取方法基于自身公知的DNA的提取方法进行即可。作为该DNA的提取方法，具体而言，例如，可举出将试样与包含表面活性剂(胆酸钠、十二烷基硫酸钠等)的处理液混合，对得到的混合液进行物理处理(搅拌、均质化、超声波粉碎等)，使试样中所含的DNA在混合液中游离从而来提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种癌细胞的判定方法，其中，其包括下述工序1～3：(1)工序1，使至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的来自细胞的核酸进行亚硫酸氢盐反应；(2)工序2，对通过工序1得到的反应产物中的至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号1所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物进行扩增；以及(3)工序3，基于使通过工序2得到的扩增产物进行电泳的结果，判定该细胞是否为癌细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.17 JP 2016-0283941.一种癌细胞的判定方法，其中，其包括下述工序1～3：(1)工序1，使至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的来自细胞的核酸进行亚硫酸氢盐反应；(2)工序2，对通过工序1得到的反应产物中的至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号1所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物进行扩增；以及(3)工序3，基于使通过工序2得到的扩增产物进行电泳的结果，判定该细胞是否为癌细胞。2.如权利要求1所述的判定方法，其中，在工序2中扩增的核酸是使至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号5所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物。3.如权利要求1所述的判定方法，其中，在工序2中扩增的核酸是使至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号4所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物。4.如权利要求1所述的判定方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：林田幸信，
申请(专利权)人：富士胶片和光纯药株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP