在正常细胞和癌细胞中检测基因表达的方法技术

本发明专利技术提供一种在正常的和癌细胞中检测基因表达的方法。特别地，提供的方法利用分子灯标（ＭＢ）技术与荧光显影技术结合，用于检测，识别或定量测定在细胞样品中各种肿瘤标记物在基因表达中的存在，或变异。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种检测人类癌细胞的方法，所述方法使用分子灯标技术，通过在正常细胞和/或癌细胞中检测肿瘤标记基因和突变致癌基因的表达水平来检测人类癌细胞。
技术介绍
乳腺癌是癌症中最常见的种类并且是居于前列的妇女致死病因。增加存活的关键因素是及早地诊断出它的存在。尽管早期的乳房X线照相术降低了该疾病的死亡率，但仍有大约20％的乳腺癌患者未能通过乳房X线照相术而被诊断出来。而且，乳房X线照相呈异常的所有病人中，仅有10％至20％通过活组织切片检查被确诊为乳腺癌(Harris etal.，In Detita VT，Lippincott-Raven；1557-1616(1997))。目前，还没有可靠的用于乳腺癌诊断的血清肿瘤标记。因此，用于乳腺癌的早期诊断的新方法的研发对于成功治疗癌症和增加病人存活率具有关键性的作用。目前，乳管灌洗法作为最少入侵手段来收集乳腺上皮细胞以用于细胞病理学分析(O’Shaughnessy et al.，Cancer 94(2)292-298(2002))。此过程包括将一个微导管插入一个乳头孔，用生理盐水灌洗管子并收集灌洗流出物。每管大约13,500细胞被收集，用于分析是否存在正常，异常，或恶性乳腺细胞。但是，目前用于识别不同细胞类型的方法是通过细胞形态学上的分类手段，通常会不准确。胰脏癌由于它的预后非常差，因而占美国的癌症致死原因的第四位(Parker et al.，CA.Cancer J.Clin.465-27(1996))。每年在美国发现大约29,000新病历，死亡28,000例(Gold E.I，Surg.Clin.North Am.75819-839(1995))。少于50％的胰脏癌病人在诊断后还能存活超过三个月，而他们中的仅8％能存活2年(NationalInstitute of HealthNIH Publication 93-2789(1993))。预后差的主要原因是患有胰脏癌的病人很少能被早期发现。使用传统的X光线照相术和超声波检查术方法很难做到胰脏癌的早期诊断(Barkin et al.，Gastroenterology Clinics of North America28709-722(1999))。尽管在过去几十年中做过很多生物医学研究的努力，但仍有90％以上的胰脏癌患者在确诊时已经发生了局部和/或全身癌症细胞的转移，经常造成时机太晚而无法治愈。因此，胰脏癌的早期诊断十分重要，可能根据分子标记比根据肿瘤大小而进行诊断会更好。胰脏癌和乳腺癌的分子标记众所周知的是，目前的K-ras致癌基因是用于胰脏癌的早期检测的最有吸引力的分子标记之一(Minamoto et al.，Cancer Detection & Prevention 241-12(2000)；Futakawa et al.，Journal of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery 763-71(2000)；Puig et al.，International Journal of Cancer 85(1)73-77(2000)；Watanabe etal.，Pancreas 17341-7(1998)；Shibata et al.，International Journal of Oncology121333-1338(1998)；Urgell et al.，European Journal of Cancer 362069-2075，2000))。作为G-蛋白中的一员，K-ras涉及从细胞表面的生长促进效应物(growth-promoting effectors)的信号转导。在80％至100％的胰脏癌病例中发现有K-ras的点突变，这就暗示着它是一种癌症检测的敏感标记(Minamoto et al.，CancerDetection & Prevention 241-12(2000))。而且，大多数这些突变集中在密码子12处，使得K-ras从便于灯标设计考虑而更有吸引力。因为K-ras突变发生在胰脏癌发展过程的早期，测试目标K-ras突变可以导致对胰脏癌的早期检测。近来，凋亡抑制剂蛋白(IAPs)成员中的基因已被发现(LaCasse et al.，Oncogene173247-3259(1998))。IAPs通过对半胱氨酸蛋白酶(caspase)活性的抑制来抑制凋亡过程中的凋亡蛋白酶级联(cascade)(Deveraux et al.，EMBO Journal 17(8)2215-2223(1998))。越来越多的证据显示，IAP蛋白中的一种，生存素(survivin)，对许多类型的癌症来说也是一种可能的肿瘤标记(Altieri et al.，Lab.Invest.791327-1333(1999)；Tanaka et al.，Clin.Cancer Res.6127-134(2000)；Moore etal.，J.of Insurance Med.33202-203(2001)；Altieri et al.，Trends in Mol.Med.7542-547(2001))。生存素通常在胎儿生长时期被表达，而不是在大多数的正常成人组织中被表达(Altieri et al.，Lab.Invest.791327-1333(1999))。从19种人类正常的和患病的组织类型中选取350万个样本进行的分析中得出的结果同样揭示出，生存素是在所有被检测的癌组织中被高水平均匀表达的四大基因的其中之一，但在正常组织中不是这样(Velculescu et al.，Nature Genetics 23387-388(1999))。最近的一项研究显示，通过免疫组织化学，免疫转渍法和RT-PCR化验，在77％的胰腺管细胞腺癌和56％的管内乳头状粘液性肿瘤(IPMT)中，发现有生存素的存在(Saton et al.，Cancer 92271-278(2001))。生存素的表达可以在胰腺管细胞腺癌的所有阶段(从I至IV)被检测，包括在胰腺癌细胞的癌转变的早期阶段。然而，生存素的表达在正常胰腺组织，癌细胞组织周边的炎症细胞和患慢性胰腺炎的病人处获取的胰腺组织中不能被检测到。在正常胰腺和其它正常组织中不出现生存素的表达的事实，使它成为用于检测胰腺癌细胞的理想的分子标记。这种从正常乳腺上皮细胞到浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma)的转变是一个多级过程，它包括乳腺组织的组织上的一系列改变，从增生，异型增生到导管原位癌(DCIS)并且发展到浸润性导管癌。已发现有几种肿瘤标记出现在导管原位癌和浸润性乳癌中。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)，是细胞周期的一种重要调节因子，它在80％的导管原位癌中被超量表达，而在正常乳腺组织中表达很少或没有表达(Weinstat-Saslow et al.，Nat Med 1(12)1257-1260(1995)；Vos et al.，J.ofPath.187(3)279-84(1999))。Her-2/neu基因的扩大和超量表达同样显示在30％的浸润性乳腺癌和60％至80％的DCIS组织中(Ja本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种探测样本中至少存在一种肿瘤标记物ｍＲＮＡ的方法，包括：Ⅰ）提供用于分析的细胞样本；Ⅱ）用靶向肿瘤标记物ｍＲＮＡ的寡核苷酸处理该样本，其中该寡核苷酸包括至少一种关联的能量供体部分和至少一种关联的能量受体部分，其中所述的寡核苷酸形成一个茎一环发卡和其中所述的供体和受体部分被至少一部分探针核苷碱基序列隔离开；Ⅲ）在适当的杂交条件下探测，确定或定量测定目标序列的杂交，其中在所述样本中存在的目标序列的存在，缺失或数量与可探测到的信号的变化相关，其中该信号与该寡核苷酸的至少一个供体或受体部分相关联；和Ⅳ）基于该寡核苷酸与被确定的目标序列的杂交的存在，缺失，或数量，探测，确定或定量测定肿瘤标记物的存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽丽，鲍刚，查尔斯斯特利，辛西娅科恩，
申请(专利权)人：艾默瑞大学，
类型：发明
国别省市：US[]