Zika病毒疫苗制造技术

本文描述了Zika病毒疫苗和组合物以及生产所述疫苗和将其施用于有需要的受试者的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】Zika病毒疫苗
本公开涉及用于纯化用于疫苗的Zika病毒的方法，具体涉及改进的蔗糖梯度处理步骤，其允许分离诸如硫酸鱼精蛋白的杂质。本公开还涉及Zika病毒疫苗和组合物以及用于生产所述疫苗和将疫苗施用于受试者以产生抗Zika病毒免疫应答的方法。
技术介绍
硫酸鱼精蛋白的不良反应已经已知多年。先前暴露于鱼精蛋白能够诱发体液免疫反应，并使易感个体易于发生随后使用该药物的不良反应。通过使用含鱼精蛋白的胰岛素或在肝素中和过程中暴露于鱼精蛋白的患者在静脉内接受大剂量鱼精蛋白后可能会发生危及生命的反应和致命的过敏反应。在没有皮下注射含鱼精蛋白的胰岛素的局部或全身性过敏反应的情况下，能够发生对静脉内鱼精蛋白的严重反应。虽然没有明确的证据表明与接种疫苗有关的硫酸鱼精蛋白过敏反应，但含有鱼精蛋白杂质的疫苗在其标签中有一项预防和禁忌警告，表明在先前剂量的含鱼精蛋白疫苗后的严重过敏反应(如，参见疾病预防控制中心网站http://www.cdc.gov/japaneseencephalitis/vaccine/)是进一步剂量的禁忌症。因此消除所述杂质是提高安全性的医学要求。另一方面，硫酸鱼精蛋白是一种极好的工具(通常比其它工具如benzonase更好)以纯化在细胞基质上生长的病毒的粗收获物。自从1947年在乌干达发现于猕猴以来，在2007年第一次在亚洲和非洲的流行地区以外发现了Zika病毒。从那时起，该病毒在法属波利尼西亚引起了大规模流行，到2015年在太平洋岛屿和南美和中美洲传播(世界卫生组织“Zika情况报告”，2016年2月5日)。有证据表明，除由伊蚊种类蚊子传播外，还可能存在其它载体，并且可通过输血、经胎盘传播和通过性传播来传播病毒(世卫组织Zika病毒情况说明，2016年2月)。尽管Zika病毒感染的症状包括轻度发热、皮疹和结膜炎，但感染与神经系统疾病之间可能存在相关性，包括妊娠期感染后的胎儿/新生儿中的吉兰-巴雷综合征和小头畸形。目前没有针对Zika病毒的特定治疗或疫苗，唯一预防措施是控制蚊子载体。由于伊蚊的广泛流通，多种传播途径以及潜在的严重的感染神经系统影响，Zika病毒对公共卫生构成严重威胁。针对Zika病毒的预防性疫苗是流行地区和传播媒介地理区域的迫切医疗需求。此外，由于Zika病毒感染对胚胎和胎儿发育具有严重后果，因此需要一种安全有效的疫苗用于生育潜能女性或怀孕妇女。怀孕期间的施用疫苗对母亲和发育中的胎儿都必须非常安全。尽管减毒活病毒疫苗非常有效，但通常认为它们施用于怀孕妇女不足够安全。在这方面，在接种疫苗的受试者中缺乏繁殖能力的灭活病毒疫苗被认为更安全。开发灭活的Zika病毒疫苗以施用于有风险的患者可以满足这种需求。
技术实现思路
在病毒纯化过程中，观察到如所预期的那样，在细胞基质上产生的病毒收获物中加入硫酸鱼精蛋白不仅去除了源自宿主细胞的DNA，而且还实际上从制剂中消除了未成熟的和非感染性的病毒颗粒。这一发现为获得高纯度的感染性病毒颗粒以用于诸如疫苗制剂的应用提供了简化、温和、可重复和广泛适用的过程。另外，令人惊讶地发现，所述硫酸鱼精蛋白能够非常有效地从病毒级分中分离，允许以高产率生产更安全的疫苗。本文公开了包含灭活的Zika病毒的病毒疫苗和组合物，以及生产所述疫苗和组合物的相关方法。还提供了施用Zika病毒疫苗以在受试者中预防Zika病毒感染和/或产生抗病毒免疫应答的方法，例如有风险暴露于Zika病毒的受试者。特别地，本专利技术涉及包含最佳灭活的Zika病毒颗粒的病毒疫苗，其中适当剂量的Zika病毒颗粒能够以至少70％的可能性，优选80％的可能性使施用病毒疫苗的受试者血清转化。本专利技术的另一个优点是生产所述疫苗和组合物的相关方法是非常有效的并提供很大程度上不含杂质特别是硫酸鱼精蛋白的纯组合物，从而允许大量生产疫苗。针对Zika病毒提供了上述的详细实验示例。本文公开的关于本专利技术的灭活Zika病毒疫苗的免疫原性的体内数据表明，该病毒具有惊人的有效免疫原性并且还具有高度的交叉保护性(在非洲和亚洲菌株中非常相似的免疫原性)。数据表明，免疫原性出乎意料地高于最近报道的灭活Zika病毒候选疫苗(Larocca等，2016，Naturedoi：10.1038/nature18952.)。灭活病毒是最安全的疫苗之一，尤其优选用于向安全性特别关注的人群(例如孕妇、儿童和免疫受损个体)递送，这使得本文公开的灭活Zika病毒特别合适。获得高滴度的灭活病毒是该领域的挑战。本文公开的用于纯化灭活的Zika病毒的方法不仅产生高产量，而且产生非常纯的药物物质。本专利技术的每个限制能够包含本专利技术的各种实施方式。因此，预计涉及任何一个要素或要素组合的本专利技术的每个限制能够包括在本专利技术的每个方面中。本专利技术的应用不限于以下说明书中阐述的或附图中所示的组件的构造和布置的细节。本专利技术能够具有其它实施方式并且能够以各种方式实践或执行。附图说明不意在按比例绘制附图。这些图仅是说明性的，并不是实现本公开所必需的。为了清楚起见，并非每个组件都可以在每个图中标记，使用多重比对包Jalview(Waterhouse等，2009，Bioinformatics25(9)1189-1191)进行比对。在附图中：图1：平均距离树(以％同一性，nt)，完整的基因组。图2：相邻连接树(以％同一性，nt)，完整的基因组。图3：成对比对-Jalview(％同一性，nt)，完整的基因组。图4：平均距离树(以％同一性，aa)，E蛋白。图5：相邻连接树(以％同一性，aa)，E蛋白。图6：成对比对-Jalview(％同一性，aa)，E蛋白。图7：比对(阴影：％同一性，aa)，E蛋白。图8：宿主细胞中病毒颗粒成熟的示例。如在黄病毒中所观察到的，颗粒的完全成熟需要通过宿主蛋白酶弗林蛋白酶对前体膜糖蛋白(prM)进行蛋白水解切割。并非所有的prM分子都被切割，导致从细胞中释放成熟的、嵌合的或未成熟样的构象。嵌合和未成熟形式通常不具感染性，只有成熟病毒颗粒具有感染性并具有血凝素(HA)/TCID50活性。(图改编自Plevka等，黄病毒的成熟起始于一个或多个二十面体独立的成核中心，EMBOreports(2011)12,602-606)。图9：从粗收获物到药物物质(疫苗)制剂的示例性下游病毒纯化方法，即本专利技术方法(A)的优选实施方式。(B)中示出了示例性病毒灭活过程的流程图。图10：选择性除去Zika病毒聚集体以及VeroHCP和LMW杂质(30×浓缩Zika病毒收获第5天的SEC-HPLC)的PS处理结果。图11：在不同时间点的PS处理之前的单独的30×浓缩Zika收获物的SEC-HPLC。图12：在不同时间点的PS处理之后的单独的30×浓缩Zika收获物的SEC-HPLC。较小的图表显示随时间观察到的细胞病变效应(CPE)。图13：制备蔗糖梯度。图14：显示了来自Zika纯化的蔗糖梯度收获物的代表性SDS-PAGE。图15：JEV和ZikaV收获物时间表/收益的比较。图16：ZikaVNIV的SEC-HPLC洗脱曲线。数据在DionexUltimate3000/Superose6Increase柱上处理。两个图都来自相同的色谱图。上图是完整的洗脱图；下图是ZIKAV洗脱峰的放大图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含灭活Zika病毒颗粒的Zika病毒疫苗，其中，所述Zika病毒疫苗能够对至少70％的施用所述Zika病毒疫苗的受试者赋予血清保护。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.23 EP 15202585.4;2016.03.18 EP 16161068.8;1.一种包含灭活Zika病毒颗粒的Zika病毒疫苗，其中，所述Zika病毒疫苗能够对至少70％的施用所述Zika病毒疫苗的受试者赋予血清保护。2.根据权利要求1所述的Zika病毒，其中，所述Zika病毒颗粒能够对至少75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的施用Zika病毒疫苗的接种疫苗受试者赋予血清保护，优选对至少80％的受试者赋予血清保护。3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其中，所述Zika病毒颗粒具有对应于由SEQIDNO：2-13或72的核酸序列中的任一个提供的DNA序列的RNA基因组、或与SEQIDNO：2-13或72中的任一个至少88％相同并且能够包裹毒性Zika病毒的变体核酸序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的疫苗，其中，所述Zika病毒颗粒具有选自由SEQIDNO：14-69中的任一个提供的氨基酸序列中的E蛋白、或与SEQIDNO：14-69中的任一个至少95％相同并且能够包裹毒性Zika病毒的变体氨基酸序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的疫苗，其中，所述Zika病毒通过化学灭活、热灭活、pH灭活或UV灭活来灭活。6.根据权利要求5所述的疫苗，其中，所述化学灭活包...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·巴尔贝罗卡尔扎多，M·内本菲尔，R·施勒格，M·韦伯，J·费鲁施，
申请(专利权)人：瓦尔尼瓦奥地利有限责任公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT