本发明专利技术涉及一种共表达H5亚型禽流感HA基因和传染性法氏囊VP2基因的重组火鸡疱疹病毒疫苗株及其应用。所述共表达H5亚型禽流感HA基因和传染性法氏囊VP2基因的重组火鸡疱疹病毒疫苗株的保藏号为CCTCC NO：V201738。本发明专利技术还提供一种用于预防禽流感病毒、传染性法氏囊病毒和马立克病毒的三联疫苗，其包含有效量的所述共表达H5亚型禽流感HA基因和传染性法氏囊VP2基因的重组火鸡疱疹病毒疫苗株。
Recombinant turkey herpesvirus vaccine strain coexpressing H5 subtype avian influenza HA protein and infectious bursal disease VP2 protein
The invention relates to a recombinant turkey herpesvirus vaccine strain co-expressing HA gene of H5 subtype avian influenza and VP2 gene of infectious bursa of Fabricius and its application. The recombinant turkey herpesvirus vaccine strain co-expressing the HA gene of H5 subtype avian influenza and the VP2 gene of infectious bursa of Fabricius has a storage number of CCTCC NO: V201738. The invention also provides a triple vaccine for the prevention of avian influenza virus, infectious bursal disease virus and Marek virus, comprising an effective amount of the recombinant turkey herpesvirus vaccine strain co-expressing the HA gene of avian influenza subtype H5 and the VP2 gene of infectious bursa disease.
【技术实现步骤摘要】
共表达H5亚型禽流感HA蛋白和传染性法氏囊VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株本申请要求2017年12月25日提交的专利技术专利申请201711428339.1的优先权。
本专利技术涉及重组病毒疫苗，具体地，涉及一种共表达H5亚型禽流感HA蛋白和传染性法氏囊VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株及其应用。
技术介绍
禽流感病毒(Avaininfluenzavirus，AIV)和传染性法氏囊病毒(Infectiousbursadiseasevirus，IBDV)是危害我国养禽业发展的两种重要病毒性传染病，给养禽业造成严重的经济损失[1]。目前，控制这两种传染性疾病的主要手段为疫苗的免疫接种。传统的疫苗虽然能够给家禽提供有效的保护，但同时也存在着很多的不足，如禽流感灭活疫苗的缺点是免疫原性差、副作用较多、使用剂量大[2]；而传染性法氏囊病疫苗的缺点主要包括：弱毒活疫苗易受母源抗体的干扰；中等毒力活疫苗对法氏囊有损伤，同时还具有扩散病毒的危险；灭活疫苗不能够诱导机体产生坚强的免疫力，不能抵抗强毒株的攻击等[3]。为了解决这些问题，近年来安全有效的重组病毒活载体疫苗成为研究的热点，如重组火鸡疱疹病毒(rHVT)疫苗等，这些疫苗具有更安全、能够在机体内持续存在、能够不受母源抗体的干扰、易于保存和运输等特点，从而弥补了传统疫苗的不足[4-5]。
技术实现思路
本专利技术构建了一株同时表达禽流感病毒(AIV)HA蛋白和传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT)。其目的是为研制禽流感病毒(AIV)-传染性法氏囊病毒(IBDV)-马立克病毒(MDV)三联苗提供方法。本专利技术以实验室构建的连续覆盖火鸡疱疹病毒(HVT)全基因组的5个重组粘粒(pFosA、pFosB、pFosC、pFosD和pFosE)(可参见申请号201410171477.6)为基础，首先在pFosE粘粒上利用转座子(Kan2-egfp)寻找另外一个外源基因的插入位点，然后分别将禽流感病毒的HA蛋白的编码核苷酸序列(SEQIDNO.1)和传染性法氏囊病毒的VP2蛋白的编码核苷酸序列(SEQIDNO.2)克隆至pCI(购自Promega)和pCAGGs[6]载体中，获得pCI-HA和pCAGG-VP2克隆。利用GatewayLR克隆技术，将pCI-HA的表达框CMV-HA-polyA插入到pFosC上HVT第053和054基因之间，把pCAGG-VP2的表达框Pec-VP2-polyA插入到pFosE上的HVT第088和第089基因之间，从而获得了共表达HA蛋白和VP2蛋白的rHVT53-HA/88-VP2。通过细胞实验和免疫效力来评估重组病毒rHVT-53-HA/88-VP2。该重组病毒rHVT-53-HA/88-VP2共表达H5亚型禽流感HA基因和传染性法氏囊VP2基因的重组火鸡疱疹病毒疫苗株，已于2017年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏号为CCTCCNO：V201738。因此，本专利技术提供下述技术方案：1.一种构建共表达H5亚型禽流感HA蛋白和传染性法氏囊VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株的方法，所述方法包括将禽流感病毒的HA蛋白的编码核苷酸序列插入在粘粒pFosC中，将传染性法氏囊病毒的VP2蛋白的编码核苷酸序列插入在粘粒pFosE上，将上述两个重组粘粒与pFosA、pFosB和pFosD一起共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF救获共表达H5亚型禽流感HA蛋白和传染性法氏囊VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株。2.第1项所述的方法，其中所述禽流感病毒的HA蛋白的编码核苷酸序列插入到粘粒pFosC的HVT第053和第054基因之间，优选地，所述禽流感病毒的HA蛋白的编码核苷酸序列的启动子为CMV强启动子。3.第1项所述的方法，其中所述传染性法氏囊病毒的VP2蛋白的编码核苷酸序列插入在粘粒pFosE的HVT第088和第089基因之间，优选地，所述传染性法氏囊病毒的VP2蛋白的编码核苷酸序列的启动子为Pec复合启动子。4.第1项所述的方法，其中所述禽流感病毒的HA蛋白如SEQIDNO.2所示。5.第4项所述的方法，，其中所述禽流感病毒的HA蛋白的编码核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。6.第1项所述的方法，其中所述传染性法氏囊VP2蛋白如SEQIDNO.4所示。7.第6项所述的方法，其中所述传染性法氏囊VP2蛋白的编码核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。8.由第1-7项中任一项的方法得到的共表达H5亚型禽流感HA蛋白和传染性法氏囊VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株。9.第8项所述的共表达H5亚型禽流感HA蛋白和传染性法氏囊VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株，其保藏号为CCTCCNO：V201738。10.第8或9项的重组火鸡疱疹病毒疫苗株在制备用于预防禽流感病毒、传染性法氏囊病毒和马立克病毒的三联疫苗中的应用。11.一种用于预防禽流感病毒、传染性法氏囊病毒和马立克病毒的三联疫苗，其包含有效量的第8或9项所述的重组火鸡疱疹病毒疫苗株。12.第11项所述的三联疫苗，其包含有效量的第9项所述的重组火鸡疱疹病毒疫苗株。13.第11项或第12项所述的三联疫苗，其用于鸡。附图说明从下面结合附图的详细描述中，本专利技术的上述特征和优点将更明显，其中：图1显示利用HVT5粘粒拯救病毒系统重组的示意图。(A)HVT5粘粒拯救病毒系统的示意图；(B)HA基因在pFosC粘粒中的插入示意图；(C)VP2基因在pFosE粘粒中的插入示意图。图2显示重组病毒PCR鉴定结果，M：DL2000DNA标记；泳道1：VP2基因；泳道2：HA基因；泳道3：HVT；泳道4：CEF。图3显示重组病毒蛋白质印迹(western-blot)鉴定结果，M：蛋白分子量标记；泳道1：rHVT-53-HA/88-VP2；泳道2：HVT；泳道3：CEF。图4显示重组病毒IFA鉴定结果。图5显示重组病毒生长动力学。图6显示抗IBDVVP2抗体检测结果。图7显示vvIBDV攻毒保护性结果。图8显示HI抗体检测结果。图9显示HPAIV攻毒保护性结果。具体实施方式下面参照具体的实施例进一步描述本专利技术，但是本领域技术人员应该理解，本专利技术并不限于这些具体的实施例。除非另外指明，下述实施方案中所用的试剂等均为市售产品。1材料1.1病毒株、质粒和细胞系火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株购自中国兽医药品监察所；禽流感病毒株A/Chicken/Guizhou/4/2013(H5N1)(简称CK/GZ/4/13)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究国家禽流感参考实验室分离并保存，传染性法氏囊病毒IBDVHLJ-0504株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病创新团队提供；pCI购自Promega公司、pCAGGs[6]质粒由本实验室按照常规分子生物学技术构建并保存(其构建方法可参见参考文献6)；pENTR购自Invitrogen公司；CEF原代及次代细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供的9-10日龄SPF鸡胚按照常规细胞学方法制备获得。1.2实验动物1日龄SPF级鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。1.3主要试剂LRClonaseII酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建共表达H5亚型禽流感HA蛋白和传染性法氏囊VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株的方法，所述方法包括将禽流感病毒的HA核苷酸序列插入在粘粒pFosC中，将传染性法氏囊病毒的VP2蛋白的编码核苷酸序列插入在粘粒pFosE上，将上述两个重组粘粒与pFosA、pFosB和pFosD一起共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF救获共表达H5亚型禽流感HA蛋白和传染性法氏囊VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株。
【技术特征摘要】
2017.12.25 CN 20171142833911.一种构建共表达H5亚型禽流感HA蛋白和传染性法氏囊VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株的方法，所述方法包括将禽流感病毒的HA核苷酸序列插入在粘粒pFosC中，将传染性法氏囊病毒的VP2蛋白的编码核苷酸序列插入在粘粒pFosE上，将上述两个重组粘粒与pFosA、pFosB和pFosD一起共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF救获共表达H5亚型禽流感HA蛋白和传染性法氏囊VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株。2.权利要求1所述的方法，其中所述禽流感病毒的HA蛋白的编码核苷酸序列插入到粘粒pFosC的HVT第053和第054基因之间，优选地，所述禽流感病毒的HA蛋白的编码核苷酸序列的启动子为CMV强启动子。3.权利要求1所述的方法，其中所述传染性法氏囊病毒的VP2蛋白的编码核苷酸序列插入在粘粒pFosE的HVT第088和第089基因之间，优选地，所述传染性法氏囊病毒的VP2蛋白的编码核苷酸序列的启动子为Pec复合...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈化兰，陈普成，姜永萍，柳金雄，邓国华，曾显营，高立，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23
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