一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。通过克隆新型猪圆环病毒——PCV3的核衣壳蛋白，利用大肠杆菌或杆状病毒表达系统成功表达得到纯度较高的PCV‑Cap蛋白。利用该蛋白，本发明专利技术首次成功研制出了针对PCV3的亚单位疫苗，所制得的疫苗抗原纯度高、安全性好、免疫原性强，且对猪等动物没有致病性，抗原在中性PH的缓冲溶液中有很好的溶解性；同时，制备方法简单且成本低，适合工业化、规模化生产；为新型猪圆环病毒的防控提供了有效、有力的手段，在PCV3的防控领域具备广阔的应用前景。

* a porcine circovirus gene engineering subunit vaccine and its preparation method and Application

The invention discloses a porcine circovirus * gene engineering subunit vaccine and a preparation method and application thereof. * by cloning the nucleocapsid protein of the new porcine circovirus, PCV3, we successfully expressed high purity PCV Cap protein by using E. coli or baculovirus expression system. Using this protein, the subunit vaccine for PCV3 has been successfully developed for the first time. The vaccine antigen has high purity, good safety, strong immunogenicity * and is not pathogenic to pigs and other animals. The antigen has good solubility in the buffer solution of neutral PH. At the same time, the preparation method is simple and the cost is low, and it is suitable for workers. Industrialization and scale production * provide effective and effective means for the prevention and control of new porcine circovirus, and have broad application prospects in the field of PCV3 prevention and control.

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用
本专利技术涉生物制药
，特别涉及一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。
技术介绍
圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，其基因组为一个2kb左右的环状单链DNA。圆环病毒可以感染多种动物，包括猪、犬、鸭、鸡、狐狸和鱼类。圆环病毒主要编码两个开放性阅读框(rep和cap)。众所周知，有两个圆环病毒可以感染猪。猪圆环病毒2型(PCV2)感染可以导致不同的临床疾病，对养猪业造成严重的经济损失，而圆环病毒1型(PCV1)不引起临床疾病。2015年，美国研究人员通过宏基因组测序，在美国检测到一个新型圆环病毒(PCV3)，该圆环病毒与皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心肌炎以及多系统炎症相关。2016年12月，华南农业大学宋长绪研究员组在我国首次检出致病性的新型猪圆环病毒—PCV3-China/GD2016病毒株，通过对PCV3毒株全基因组和其部分基因的遗传进化研究发现，PCV3与PCV1和PCV2处于不同的进化分支(图1)，属于新型的猪圆环病毒(Genomecharacterizationofaporcinecircovirustype3inSouthChina,ChangxuSong,TransboundEmergDis.2017Mar13.)。目前，不管是国际还是国内，都没有PCV3疫苗，但疫苗是控制该病的重要手段。而现有的PCV2疫苗对PCV3的防控无效，因此，PCV3疫苗的研发迫在眉睫。基因工程亚单位疫苗(Subunitvaccine)又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，是指将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并以基因产物-蛋白质或多肽制成疫苗。与传统减毒苗或灭活苗相比，安全性高，纯度高，稳定性好，产量高。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，利用PCV3的核衣壳蛋白研制基因工程疫苗，用于防控PCV3。本专利技术的又一目的在于提供所述疫苗的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供所述疫苗的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，包含一种可溶性融合蛋白，所述的可溶性融合蛋白具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。所述的可溶性融合蛋白是免疫活性成分，其来自于猪圆环病毒3型核衣壳蛋白，特别是来自于猪圆环病毒PCV3-China/GD2016病毒株。所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗还包括佐剂；优选为氢氧化铝胶佐剂和水包油佐剂中的一种或至少两种；进一步优选为SEPPIC公司的MONTANIDETMISA15AVG和ISA206VG中的一种或两种。编码所述的可溶性融合蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO.2所示。所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：将编码所述的可溶性融合蛋白的核苷酸序列克隆入表达载体构建重组表达载体；将所述重组表达载体转入表达系统中进行表达，纯化，得到所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗。所述的构建重组表达载体的具体步骤优选为：针对编码所述的可溶性融合蛋白的核苷酸序列，通过设计引物进行PCR，将得到的PCV3-Cap基因片段双酶切后与表达载体连接构建得到重组表达载体。其中，所述的引物为：上游引物：5’-GGCggatccATGAGACACAGACCTATATTC-3’，下游引物为：5’-GGGctcgagGAGAACTGACTTGTAACGAAT-3’，其中，小写字母分别表示酶切位点BamHI和XhoI。所述的双酶切的方法优选为通过限制性内切酶BamHI和XhoI对PCV3-Cap基因片段和载体分别进行双酶切。所述的表达系统优选为大肠杆菌、杆状病毒表达系统、真核哺乳动物细胞表达系统和植物表达系统中的一种或至少两种；进一步优选为大肠杆菌(Rosetta菌株)和杆状病毒表达系统中的一种或至少两种。当所述的表达系统为大肠杆菌时，所述的表达的具体步骤优选为将阳性重组子转化大肠杆菌，通过IPTG诱导表达。当所述的表达系统为大肠杆菌时，所述的表达载体优选为pET-28a；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌(Rosetta菌株)。当所述的表达系统为杆状病毒表达系统时，所述的表达载体为pFASTBac-HTB。当所述的表达系统为杆状病毒表达系统时，所述的表达的具体步骤为：将阳性重组子转化入DH10Bac，在所得菌液中分离得到重组杆粒，再将重组杆粒转染Sf9细胞后进行大量培养。上述的核苷酸序列、氨基酸序列，包含但不限于：将本专利技术所提供的序列，经突变(mutation)、删除(deletion)、插入(insertion)、或取代(replacement)等现有方式，将1至复数个核苷酸或氨基酸改变，但仍适用本专利技术目的。更优选地，其应至少具有80％的序列互补性(complementary)，或是至少90％的序列同一性(Identitty)。所述的删除还包括删除第1～35位中的1至复数个氨基酸；进一步优选为删除包含第1-28位中的1至复数个氨基酸。所述的纯化优选为通过Ni-NTAHis镍柱进行纯化。所述的疫苗在预防和/或治疗猪圆环病毒III型引起的猪相关疾病中的应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1.本专利技术的专利技术人首次成功研制出了针对新型猪圆环病毒——猪圆环病毒III型的疫苗，为新型猪圆环病毒III型的防控提供了有效、有力的手段，在防控猪圆环病毒III型的领域具备广阔的应用前景。2.本专利技术的猪圆环病毒III型疫苗抗原纯度高、安全性好，免疫原性强，且对猪等动物没有致病性；同时抗原在中性PH的缓冲溶液中有很好的溶解性，有效降低免疫后的猪中相关组织中病毒含量。3.本专利技术的疫苗制备工艺相对简单，成本低，适合工业化、规模化生产。附图说明图1是PCV3-China/GD2016病毒株的系统进化树图。图2是实施例1中重组质粒pET28a-PCV3Cap的质粒图谱图。图3是实施例2中重组质粒pFastBac-HTB-PCV3Cap的质粒图谱图。图4是实施例1重组质粒转化的大肠杆菌(Rosetta菌株)SDS-PAGE分析电泳图，其中，对照为未诱导的重组大肠杆菌Rosetta，Marker为蛋白分子量标准，Cap-Ecoli为经IPTG诱导的重组大肠杆菌Rosetta。图5是实施例2重组杆粒的SDS-PAGE分析电泳图，其中，M为蛋白marker，Cap-sf9为转染重组杆粒，对照为pFastBac-HTB空载杆粒。图6是纯化后的Cap蛋白SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白marker，泳道1为实施例1制得的重组蛋白Cap-Ecoli，泳道2为实施例2制得的重组蛋白Cap-sf9。图7是实施例3中免疫后3周测特异性抗体滴度的结果分析图。图8是实施例3中攻毒14天后淋巴结中PCV3病毒含量测定的结果分析图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例中所用的蛋白分子量标准(14.4～116kD)购自碧云天生物技术公司。实施例1通过大肠杆菌表达重组Cap蛋白1.基因扩增以PCV3-China/GD2016病毒株(PCV3-China/GD2016基因组信息已于论文中Genomecharacterizatio本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，包含一种可溶性融合蛋白，其特征在于：所述的可溶性融合蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或是具有通过突变、删除、插入或取代方式将如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的至少1个氨基酸改变的序列。

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，包含一种可溶性融合蛋白，其特征在于：所述的可溶性融合蛋白具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；或是具有通过突变、删除、插入或取代方式将如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列中的至少1个氨基酸改变的序列。2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于：所述的可溶性融合蛋白是免疫活性成分，其来自于猪圆环病毒3型核衣壳蛋白。3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于：所述的可溶性融合蛋白来自于猪圆环病毒PCV3-China/GD2016病毒株。4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于：所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗还包括佐剂。5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于：编码所述的可溶性融合蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO.2所示。6.权利要求1～5任一项所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋长绪，王磊，刘业兵，申翰钦，张乐宜，刘艳玲，梁鹏帅，张鹏飞，刘相聪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44