一种烟草黄化病判定方法技术

本发明专利技术涉及一种烟草黄化病判定方法，包括如下步骤：步骤（1）、样品的采集；步骤（2）、样品的制备；步骤（3）、红外扫描；步骤（4）、结果分析判定。本发明专利技术操作时间短，判定结果准确，可以在早期诊断出烟草是否为黄化烟草，进而及时进行相应的治疗，第一时间消除烟草黄化的风险，减少生产损失，节约人力物力，提高烟草的品质，具有重要的经济价值。

A method for determining tobacco yellowing disease

The invention relates to a method for judging tobacco yellowing disease, which comprises the following steps: step (1), sample collection; step (2), sample preparation; step (3), infrared scanning; step (4), result analysis and judgment. The invention has the advantages of short operation time, accurate determination result, early diagnosis of whether tobacco is yellowing tobacco, and timely treatment, eliminating the risk of tobacco yellowing, reducing production losses, saving manpower and material resources, improving the quality of tobacco, and has important economic value.

【技术实现步骤摘要】
一种烟草黄化病判定方法
本专利技术涉及一种黄化病诊断筛选方法，具体涉及一种烟草黄化病诊断筛选方法。
技术介绍
黄化病，是植物的一种病征。指茎叶的一部或全部退绿，而出现黄色、黄白色或黄绿色的现象，是植物的主要病变之一。这种病有的是由于线虫、细菌类、病毒、支原体（Mycoplasma）等病原体而引起的疾病；有的是由于养分的过分不足而引起的生理性疾病。其根据病原不同又可分为两种类型。1.生理性黄化病：该病病因较多，其中较为常见的是缺铁性黄化，多发生于北方地区栽培喜酸性花卉如杜鹃、栀子、八仙花、茉莉等时新叶发黄，严重时叶片变褐干枯。此外缺硫、缺氮以及光照过强、浇水过多、低温、干旱等也会引起叶片黄化。此类病害主要通过加强栽培管理、合理施肥等措施解决，一般不需用药。2.病理性黄化病:这是一类由类菌原体(一种介于细菌与病毒之间的微生物)引起的传染性病害，如翠菊黄化病、天人菊黄化病、菊花黄化病、飞燕草黄化病、柑橙桔柚树的黄化病等。黄化病株主要生化特征：坏死叶片中固醇的含量显著下降，氨基酸代谢失常；黄化突变体的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素含量降低，其中叶绿素b变化明显，黄化突变体的净光合速率和蒸腾速率总体小于其它品种，气孔导度值差异较小，总体降低，胞间CO2浓度日变化值均高于其它品种。发生黄化的植物往往生长发育迟缓，枝条丛生，叶小且颜色逐渐变淡至黄色或黄绿色，严重时可能引起整个植株的死亡，导致植物的经济效益降低，植物黄化的普遍程度在不断加大。烟草在我国是重要的经济作物之一，种植烟草的主要目的是收获叶片，通过工业加工制成各种烟制品，满足消费者需求。因此，烟叶品质的差异，直接影响着成品烟制品的品质。为了选育出优质的种质，国家局已将基因组编辑工厂化育种确定为重要战略工程。然而，针对大量基因编辑素材，如何进行高通量的分析评价，已经成为当前基因编辑育种技术中的研究重点。对于基因编辑素材出现的病害，我们希望通过以差异性分析为基础，围绕素材病害特征为研究核心开发高通量的筛选方法。烟草黄化病是烟草栽培区普遍存在的烟草病害之一，其种类众多，分布也比较广，给烟草生产造成了巨大的影响。然而，目前并不能提前诊断出烟草是否为黄化烟草，只能待其病变后通过肉眼才能被发现，不能够及时采用相应的防治方法，造成人力和物力的浪费，严重影响生产和烟草品质。因此，针对烟草的黄化诊断筛选，急需一种可以快速、准确、在早期诊断黄化烟叶的方法，进一步采用相应的防治方法降低黄化病的危害。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种烟草黄化病判定方法。本专利技术目的通过下列技术方案予以实现：一种烟草黄化病判定方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、样品的采集选择烟草试材，采用无菌组织培养育苗，待烟苗达到10cm左右后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入团颗期、或旺长期或现蕾期时取样，取中部第8-12片烟叶中的一片或多片烟叶；步骤（2）、样品的制备将步骤（1）的烟叶去除叶脉取叶片，在液氮环境下将烟叶放入玛瑙研钵，冷冻研磨为细粉，然后进行冷冻干燥；步骤（3）、红外扫描取样磨粉压片，然后进行红外测试；扫描时自动扣除H2O和CO2的干扰，得到原始光谱依次进行吸光度、自动基线校正、归一化处理得相应的标准化光谱；步骤（4）、结果分析判定根据步骤（3）的标准化光谱，进行判定，当满足下列条件时，即可判定该烟草试材为黄化烟草，判定条件如下：A、在1620-1624cm-1和1527-1532cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；B、在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为0.22-0.31；D、在1382-1386cm-1和827-832cm-1处同时出现明显硝酸盐的N-O收缩振动和变形振动吸收峰。进一步地，步骤（1）中，选用的原料品种为红花大金元烟叶。进一步地，步骤（2）中，冷冻干燥的条件是：放入-80℃冷冻干燥机中，干燥24hr。进一步地，步骤（3）中，取样磨粉压片具体为：取样品粉末约2mg，加入光谱纯溴化钾约100mg混合研磨均匀后放入压片模具，8t压力下保持2min。5、根据权利要求1所述的烟草黄化病诊断筛选方法，其特征在于：步骤（3）中，扫描次数为32次，分辨率为4cm-1，扫描范围为4000～400cm-1；每个样品进行3次测试求平均值来消除误差。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：（1）本专利技术操作时间短，仅需要2min就可以高通量快速诊断分析，可以用于基因编辑素材的早期病害诊断和病害分析等的高通量初级筛选。（2）本专利技术诊断结果准确，无需再经过后续复杂分析，即可判断出会黄化的烟叶，且能够涵盖所有烟草黄化的类型。采用定量分析，对诊断出的黄化烟叶和正常烟叶中的总糖、蛋白质、硝酸盐进行测定，定量分析测试结果与本专利技术判断结果一致；采用主成分分析的马氏距离判别模型对诊断出的黄化烟叶和正常烟叶进行分析，两类烟叶存在明显的边界，且间隔较大，具有较好的区分效果，表明本专利技术方法可以明显的将黄化烟叶与正常烟叶的将其区分。（3）本专利技术方法可以在早期诊断出烟草是否为黄化烟草，进而及时进行相应的治疗，第一时间消除烟草黄化的风险，减少生产损失，节约人力物力，提高烟草的品质，具有重要的经济价值。附图说明图1为样品1和样品2的FTIR图谱。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所做的任何变换或改进，均落入本专利技术的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1本实施例的烟草黄化病判定方法，包括如下步骤：步骤（1）、样品的采集以红花大金元烟叶为试材，标记样品1，按常规的无菌组织培养育苗，培养条件为一天光照16hr，温度25-28℃，待烟苗达到10cm后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入现蕾期取样，取中部第8片烟叶。步骤（2）、样品的制备烟叶取好后，去除叶脉取叶片，用液氮环境下将烟叶放入玛瑙研钵，冷冻研磨为细粉，放入-80℃冷冻干燥机中，干燥24hr。步骤（3）、红外扫描取样品粉末约2mg，加入光谱纯溴化钾约100mg混合研磨均匀后放入压片模具，8t压力下保持2min，然后进行红外测试。扫描次数为32次，分辨率为4cm-1，扫描范围为4000～400cm-1，扫描时自动扣除H2O和CO2的干扰，每个样品进行3次测试求平均值来消除误差。本实施例中，原始光谱采用Perkin-Elmer公司的专业红外光谱软件（Spectrum10）依次进行吸光度、自动基线校正、归一化处理得相应的标准化光谱。样品图如图1所示。步骤（4）、结果分析判定根据步骤（3）的标准化光谱，分析结果如表1所示，从表1可以看出：A、样品1在1620-1624cm-1和1527-1532cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；B、样品1在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草黄化病判定方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、样品的采集选择烟草试材，采用无菌组织培养育苗，待烟苗达到10cm左右后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入团颗期、或旺长期或现蕾期时取样，取中部第8‑12片烟叶中的一片或多片烟叶；步骤（2）、样品的制备将步骤（1）的烟叶去除叶脉取叶片，在液氮环境下将烟叶放入玛瑙研钵，冷冻研磨为细粉，然后进行冷冻干燥；步骤（3）、红外扫描取样磨粉压片，然后进行红外测试；扫描时自动扣除H2O和CO2的干扰，得到原始光谱依次进行吸光度、自动基线校正、归一化处理得相应的标准化光谱；步骤（4）、结果分析判定根据步骤（3）的标准化光谱，进行判定，当满足下列条件时，即可判定该烟草试材为黄化烟草，判定条件如下：A、在1620‑1624 cm‑1和1527‑1532 cm‑1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；B、在1075‑1079cm‑1处出现多糖吸收I带吸收峰；C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为0.22‑0.31；D、在1382‑1386 cm‑1和827‑832 cm‑1处同时出现明显硝酸盐的N‑O收缩振动和变形振动吸收峰。...

【技术特征摘要】
1.一种烟草黄化病判定方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、样品的采集选择烟草试材，采用无菌组织培养育苗，待烟苗达到10cm左右后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入团颗期、或旺长期或现蕾期时取样，取中部第8-12片烟叶中的一片或多片烟叶；步骤（2）、样品的制备将步骤（1）的烟叶去除叶脉取叶片，在液氮环境下将烟叶放入玛瑙研钵，冷冻研磨为细粉，然后进行冷冻干燥；步骤（3）、红外扫描取样磨粉压片，然后进行红外测试；扫描时自动扣除H2O和CO2的干扰，得到原始光谱依次进行吸光度、自动基线校正、归一化处理得相应的标准化光谱；步骤（4）、结果分析判定根据步骤（3）的标准化光谱，进行判定，当满足下列条件时，即可判定该烟草试材为黄化烟草，判定条件如下：A、在1620-1624cm-1和1527-1532cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；B、在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；C、选用多...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建华，陈章玉，李雪梅，张承明，杨光宇，张涛，许力，邓乐乐，王晋，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53