用于早期乳腺癌症诊断的微小核糖核酸制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及早期乳腺癌标记物及其检测治疗方法，本发明专利技术基于多种微小核糖核酸在早期乳腺癌细胞中的表达强度差异开发出可用于早期乳腺癌分子诊断和治疗的生物小分子。本发明专利技术的早期乳腺癌标记物具有检出谱系广、灵敏度高、特异性好、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于乳腺癌早期普查和预后等相关工作，改进单一的标记物或目前临床广泛应用的生物标记物本身的不稳定性所难以克服的个体差异、所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高早期乳腺癌不同亚型的临床检出率、降低对乳腺癌误诊率和漏诊率，成为早期乳腺癌诊断和个性化治疗的有效手段。

MicroRNA for early breast cancer diagnosis

The invention belongs to the field of biotechnology, and relates to early breast cancer markers and detection and treatment methods. Based on the different expression intensity of various microRNAs in early breast cancer cells, the invention develops small biological molecules which can be used for molecular diagnosis and treatment of early breast cancer. The early breast cancer marker of the invention has the advantages of wide detection spectrum, high sensitivity, good specificity, low detection cost, convenient sampling, easy storage of samples, etc. The method can be widely used in the early screening and prognosis of breast cancer and other related work, improving the single marker or the biomarker itself widely used in clinical practice. Individual differences, low specificity and low sensitivity caused by instability can significantly improve the clinical detection rate of different subtypes of early breast cancer, reduce the misdiagnosis rate and missed diagnosis rate of breast cancer, and become an effective means of early breast cancer diagnosis and personalized treatment.

【技术实现步骤摘要】
用于早期乳腺癌症诊断的微小核糖核酸
本专利技术属于生物
，涉及人体体液中微小核糖核酸在早期乳腺癌中早期筛查及精准用药检测方法。
技术介绍
微小核糖核酸本文所述的专利技术是基于以下观察：某些微小核糖核酸(miRNAs)将改变雌激素受体阿尔法66型和雌激素受体阿尔法36在细胞内的表达。正如本文所述，本项目专利技术人发现，某些细胞对汤吗希芬抗性会被改变，使得其对汤吗希芬的治疗更为敏感.特别是，专利技术人发现，微小核糖核酸let-7等在某些细胞内能显著抑制雌激素受体阿尔法66及阿尔法36的表达，从而增加这些细胞对汤吗希芬治疗的灵敏度。本专利技术包括多聚核苷酸及其使用。本文中所使用的术语“多聚核苷酸”是指任何长度的核苷酸聚合形式，无论是核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，由肽链演变而来的核苷酸链分子，或兼而有之，既包括单链分子，双链复式单位。多聚核苷酸获得包括直接来自天然来源，或通过分子重组技术、酶学反应修饰、或化学技术等技术获得。本专利技术的多聚核苷酸可以通过分离提取获得。分离提取多聚核苷酸指的是从其自然环境中挪去。而由基因重组，酶学反应技术或化学方法生产的多核苷酸指指的是定义上的分离与纯化，因为他们从来没有在自然环境中存在过。此处使用的“基因”是指一种核苷酸序列，编码mRNA或未转录加工过的RNA[例如，一个RNA分子，包括外显子和内含子及转录加工后产生的信使核糖核苷酸(mRNA)，或转录加工后的原型态微小核糖核酸(Pri-miRNA)]。基因在其5′端有转录起始位点，在其3’端有转录终止的信号。本文所用的“目标基因”，是指一个特定的基因，其表达会被本专利技术中多聚核苷酸抑制。本文所用的“目标mRNA”是由目标基因编码的mRNA。除非另有说明，目标基因可导致多个完全不同的mRNA，而这些mRNA的产生是由于使用了多种不同组合的外显子。这些相关的mRNA被称为剪接变异体或基因转录的变体。本专利技术的多聚核苷酸可称为有意义链。有意义链一般由17到30个核苷酸组成，例如17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个核苷酸。有意义链与目标mRNA序列一样，或者完全相同。本文中所使用的术语“相同”是指有意义链的核苷酸序列具有相同的多聚核苷酸的一个部分，如目标mRNA的核苷酸序列。本文中所使用的术语“实质上相同”是指有意义链序列与目标mRNA序列有一个或多个不同，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11个核苷酸，其余核苷酸序列与目标mRNA是相同的。本专利技术的多核苷酸可称为反义链。反义链之间可能有17和30个核苷酸，例如，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个核苷酸。反义链序列是基本上或完全与目标RNA互补的。所谓“互补”是指两个单链多核苷酸的碱基对彼此配对，即，一个多核苷酸腺嘌呤将与第二个多核苷酸链中胸腺嘧啶碱基配对，或者，一条多核苷酸链的胞嘧啶或尿嘧啶碱基将与第二条多核苷酸链的鸟嘌呤配对。反义链是指与另一条多核苷酸链“互补”的链(如目标mRNA)。它是指反义链的核苷酸与另一条多核苷酸链的核苷酸序列互补(如目标mRNA)。本文中所使用的术语“基本上互补”是指反义链还有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11个核苷酸未能与另一条多核苷酸链上的核苷酸序列(例如，靶mRNA)互补。实例之一，反义链可能有1，2或3个核苷酸碱基未能配对，也就是说，在一条多核苷酸链上(如目标mRNA)，可能有1、2、或3个核苷酸碱基不能与之互补[见图13，其中序列号(SEQID)：17-24中，每条序列中都有一个与目标序列号16中未能配对的核苷酸]。实例之二，一条多核苷酸链(如目标mRNA)可能包括1，2或3个核苷酸碱基未能配对，也就是说，没有在一个与本专利技术中多核苷酸反义链相应碱基互补。本专利技术的多核苷酸还包括与本专利技术中双链RNA(dsRNA)相对应的双链DNA，其中包括不同长度的双链多聚核苷酸中有意义链和反义链(Marquesetal.，Nat.Biotech.，24：559-565(2006))。本专利技术中还包括单链RNA多核苷酸以及与本专利技术中相对应于有意义链及反意义链的单链DNA。同时，还包括只需要把胸腺嘧啶换成尿嘧啶核苷后，任何从DNA序列转化成RNA的序列。本专利技术的多核苷酸还可能包括从双链多聚核苷酸一端或两端伸出的都分核苷酸序列。伸出部分包括出现在双链多聚核苷酸链中任意一条非配对的一个或多个核苷酸；如，与另一条双股多核苷酸链中不能配对互补的核苷酸。这个伸出链也许位于有意义链或反意义链或两者的3‘-端。这个伸出架构通常1、2或3个核苷酸长度。实例一，这个伸出序列位于3’-端，并且，含有胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(或尿嘧啶-尿嘧啶如果它是RNA)结构。如果没有限制，这种伸出结构可能被用来增加一个双链RNA的稳定性。伸出架构的存在，并不能用来确定该有义链是否与目标基因序列完全相同或大体上相同，也不能用来确定该有意义链是否与目标基因mRNA完全互补或大体上互补。本专利技术中双链多聚核糖核酸有意义链和反意义链也许也是共价结合的，比如，由几个核苷酸组成的分隔体结构。这样的多聚核糖核酸结构叫做短的发卡RNA(shRNA)。根据基本的有意义链与反意义链的配对原则，这样空间区域通常形成一个环状结构。组成的环状结构的核苷酸数目通常不一样，据报道这个核苷酸数目通常在3到23个(Suietal.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，99：5515-5520(2002)，andJacqueetal.，Nature，418：435-438(2002)).实例一，短的发卡结构包括一条有意义链，紧接着是一个核苷酸环状结构及其反意义链类似物。例如，在核苷酸环状结构之前是反意义链，并紧随着有意义链。本专利技术描述的多聚核苷酸也可以有不同修饰。这些修饰通常是为了提高多核苷酸在特定环境中的稳定性。这些修饰包括核酸塘基、碱基、或骨架结构、或以上任何一种的组合。这些修饰可能是合成的、自然界存在的或非自然界存在的。本专利技术中多聚核苷酸包括修饰一个或多个存在于多核苷酸中的核苷酸。例如，骨架结构修饰包括(但并不局限于)磷酸乙酰、三磷酸乙酰、磷酸酯，phosphorodithioates，磷酸酰氨、甲基磷酸化、手性甲基膦酸，2氧甲基核糖核酸以及多肽核苷酸。例如，核苷酸碱基修饰(但不局限于)包括：肌苷，嘌呤，4-吡啶，2-吡啶，苯，假尿嘧啶，2，4，6-三甲氧苯，3-甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，萘，氨基苯，5-烷基胞嘧啶类(例如，5-甲基胞嘧啶)，5-烷基尿嘧啶类(例如，核糖胸腺嘧啶)，5-环尿嘧啶类(例如，5-溴尿嘧啶)或6-杂氮嘧啶类或6-烷基嘧啶类(如6-甲基尿嘧啶)，或丙炔修饰。例如，核苷酸塘基修饰(但不局限于)包括：2′-糖修饰，如.，2′-氧-甲基核苷酸，2′-去氧-2′-氟核苷酸，2′-去氧-2′-fluoroarabino，2′-氧-甲氧核苷酸，2′-氧-三氟甲基核苷酸，2′-氧-乙基三氟甲氧基乙基-核苷酸，2′-氧-二氟甲氧基乙氧基核苷酸，或2′-去氧核苷酸。多核苷酸及其修饰可通过商业购买或合成获得(譬如，Pharmacon公司，Lafayette，CO)。本专利技术多核苷酸是类有生物活性的分子。生物活性分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.该专利技术包括以下几个方面：用于诊断或治疗病人体内携带对抗雌激素及其类似物如汤马细粉(Tamoxifen)、赫赛汀(herceptin)等有抗性的癌症细胞；以及与治疗前相比，单一核苷酸能显著地增加病人体内对抗雌激素及其类似物的敏感性癌症细胞数目。

【技术特征摘要】
1.该发明包括以下几个方面：用于诊断或治疗病人体内携带对抗雌激素及其类似物如汤马细粉(Tamoxifen)、赫赛汀(herceptin)等有抗性的癌症细胞；以及与治疗前相比，单一核苷酸能显著地增加病人体内对抗雌激素及其类似物的敏感性癌症细胞数目。2.权利要求1中乳腺癌细胞在治疗前，是野生型雌激素受体(ER-α66)阳性细胞，或野生型雌激素受体阴性细胞。3.权利要求1中所描述的进一步涵盖用来确定乳腺癌细胞在治疗前是野生型雌激素受体阳性或阴性细胞。4.权利要求1所用的方法中的癌细胞在治疗前是变异型雌激素受体(ER-α36)阳性或阴性。5.权利要求1所用的方法中进一步包括用来确定癌细胞在治疗前是变异型雌激素受体阳性或阴性。6.权利要求1所用的方法中的癌细胞在治疗前是变异型雌激素受体阳性及野生型阴性。7.权利要求1所用的方法中进一步包括应用选择性雌激素受体调节剂(SERM)的治疗。8.因此，权利要求6所用的方法中SERM包括汤马细粉及赫赛汀。9.权利要求1所用的方法中的多聚核苷酸主要指ER-α36mRNA互补的核苷酸序列5’-UUAACACCAGGAAGGCCUACCUCAUU(SEQIDNO：16)。10.权利要求9所用的方法中所指的13到18核苷酸长度的多聚核苷酸是与序列16中至少20个核苷酸序列互补的序列(5’-UUAACACCAGGAAGGCCUACCUCAUU)(SEQIDNO：16)。11.权利要求1所用的方法中的多聚核苷酸主要指ER-α66mRNA互补的核苷酸序列5’-UUUUUCUAAGUAAUUGCUGCCUCUUU(SEQIDNO：6)[ERa66mRNA]。12.权利要求11所用的方法中所指的14到18核苷酸长度的多聚核苷酸是与序列6中至少20个核苷酸序列互补的序列5’-UUUUUCUAAGUAAUUGCUGCCUCUUU(SEQIDNO：6)。13.权利要求1所用的方法中的多聚核苷酸长度在17到29个核苷酸之间。14.权利要求1所用的方法中癌症细胞指乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌细胞及直肠癌。15.方法包括：治疗病人所需的多聚核糖核酸可使癌症细胞内雌激素受体量显著减少的有效剂量。16.权利要求15所用的方法中包括鉴定病人体内是否有癌症细胞及癌症细胞呈螆激素受体ER-α66阳性或阴性。17.权利要求15所用的方法中包括鉴定病人体内是否有癌症细胞及癌症细胞呈雌受体ER-α36阳性或阴性。18.权利要求15所用的方法中癌症细胞是雌激素受体ER-α66阴性或ER-α36阳性。19.权利要求18所用的方法中癌症细胞也是孕激素受体阴性及人表皮生长因子受体2(HER2)阴性。20.权利要求15所用的方法中多聚核苷酸实际上是与ER-α36信使RNA完全互补的核苷酸序列5’-UUAACACCAGGAAGGCCUACCUCAUU(SEQIDNO：16)[ER-α36mRNA]。21.权利要求20所用的方法中多聚核苷酸中的13-19个核苷酸是与以下序列完全互补的核苷酸序列5’-UUAACACCAGGAAGGCCUACCUCAUU(SEQIDNO：16)。22.权利要求21所用的方法中多聚核苷酸是从以下序列中(序列17到序列24)选择而来的(SEQIDNO：17，SEQIDNO：18，SEQIDNO：19，SEQIDNO：20，SEQIDNO：21，SEQIDNO：22，SEQIDNO：23，SEQIDNO：24)。23.权利要求15所用方法中多聚核苷酸与16号序列完全互补的序列：5’-UUUCUAAGUAAUUGCUGCCUCU(SEQIDNO：6)[ER-α66mRNA]。24.权利要求23所用方法中的多聚核苷酸序列中的15到17个核苷酸是与以下序列互补的序列：5’-UUUCUAAGUAAUUGCUGCCUCU(SEQIDNO：6)。25.权利要求24中的多聚核苷酸序列是从以下序列17到24号序列中选择而来的：SEQIDNO：17，SEQIDNO：18，SEQIDNO：19，SEQIDNO：20，SEQIDNO：21，SEQIDNO：22，SEQIDNO：23，SEQIDNO：24。26.权利要求15中的多聚核苷酸是双股链；而且是双股多聚核糖核苷酸；并且，双股多聚核苷酸由核糖核苷酸组成。27.权利要求26中的双链多聚核苷酸形成去氧核苷酸。28.权利要求26中双...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖晓莺，
申请(专利权)人：肖晓莺，
类型：发明
国别省市：湖南,43