一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌致病力的检测方法，属于作物病原菌检测技术领域。本发明专利技术利用菌悬液作为接种物，接种在番茄叶片上，人工接种后3天，在番茄叶片上便能产生明显的病症，症状与猕猴桃寄主叶片病斑症状相似，利用番茄叶片症状与猕猴桃叶片症状相似的特点，来测定病菌的致病力。采用本发明专利技术提供的方法可随时满足新分离病菌及不同保存时间病菌的致病力快速检测需求，具有较好的适用性。

【技术实现步骤摘要】
一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法
本专利技术属于作物病原菌检测
，具体涉及一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法。
技术介绍
猕猴桃细菌性溃疡病(Kiwifruitbacterialcanker)是猕猴桃生产上的一种毁灭性细菌性病害，现被列为全国森林植物检疫对象。近年来，随着猕猴桃栽培面积迅速扩大，猕猴桃细菌性溃疡病传播范围也逐渐增大。先后在湖南、安徽、陕西、四川、重庆等地发现了此病，流行年份致使全园濒于毁灭，造成了巨大的经济损失。猕猴桃溃疡病是一种由丁香假单孢杆菌猕猴桃致病种(Pseudomonassyringaepv.Actinidae,Psa)侵染引起，病害发生始期一般处于植株休眠期，2～3月在猕猴桃萌芽前进入发病高峰，主要危害主干、主枝和侧枝，4～5月新叶长出后，病菌可转移侵染叶片，5月后随着气温的升高，发病减轻。鉴于猕猴桃细菌性溃疡病传播迅速，因此，在田间开展病菌致病力测定风险较大。目前有关猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力检测方法多见于采用新生的猕猴桃离体叶片针刺喷菌液接种法及表皮微量菌液注射接种法，但采用此种方法存在以下问题：接种伤口处的菌液量少，保湿条件下的猕猴桃叶片在离体后2天易失绿萎黄，健康程度远不及活体植株叶片，对病菌致病力测定的真实性有明显影响，而采用猕猴桃枝干伤口喷菌法，因取材不便捷、不统一，发病时间及接种效果不稳定，因此，较少用于不同菌株间的致病力测定和评价。猕猴桃属落叶植物，该病害发生高峰期往往是植株落叶休眠期至萌芽期，新叶尚未长出，分离到的菌株无法及时在猕猴桃叶片上开展致病力检测。因此，寻找一种有效的、简便的猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的快速检测方法用于病菌致病力评价及该病害的防治研究具有重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法，能够随时快速检测。为了解决上述问题，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法，包括如下步骤：1)在番茄植株的叶片上沿叶脉两侧各刺1个小孔，在所述小孔中接种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液，得到接种病菌的番茄植株；2)将所述步骤1)中接种病菌的番茄植株在20～30℃，相对湿度在75～90％的条件下生长3～4天后，在所述小孔周围测量叶肉组织变褐色部位的直径，依据褐色部位的直径判断致病力，当褐色部位的直径≤1.00mm，为弱致病力菌株；当1mm<褐色部位的直径≤2.50mm，为中等致病力菌株；当2.5mm<褐色部位的直径，为强致病力菌株。优选的，所述步骤1)中猕猴桃细菌性溃疡病病菌菌悬液的浓度为5～10×108CFU/mL，猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液的接种量为30～40μL/孔。优选的，所述步骤1)小孔的直径为4～6mm。优选的，所述步骤2)中测量叶肉组织变褐色部位直径的方法为十字交叉法。优选的，每一株猕猴桃细菌性溃疡病菌接种3颗番茄植株，每颗番茄植株至少接种4个小孔。优选的，所述步骤1)中番茄植株叶片为番茄植株中上部，叶龄为20～30d的健康叶片。优选的，所述步骤1)中猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液的制备方法包括如下步骤：A.将猕猴桃细菌性溃疡病菌菌种在蛋白胨酵母粉培养基的平板上划线，在25～28℃条件下黑暗培养72～96h，得到扩大培养后的猕猴桃细菌性溃疡病菌；B.将所述步骤A的扩大培养后的猕猴桃细菌性溃疡病菌与无菌水混合，得到猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液。优选的，所述步骤A中蛋白胨酵母粉培养基每1000mL包括以下组分：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂粉17g，加水定容至1000mL，pH值为7.0～7.2。优选的，所述步骤A中猕猴桃细菌性溃疡病菌菌株在平板划线前进行活化。优选的，所述活化的方式为：将猕猴桃细菌性溃疡病菌接种到牛肉浸膏蛋白胨培养液中，在150～180rpm，25～28℃温条件下振荡培养72～96h；所述牛肉浸膏蛋白胨培养液包括以下组分：牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖2.5g、加水定容至1000mL，pH值为7.0～7.2。本专利技术提供了一种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌致病力的检测方法，本专利技术利用菌悬液作为接种物，避免了培养基营养成份的干扰，同时利用菌悬液对番茄叶片的附着性，结合活体植株番茄叶片针刺伤口加菌悬液液滴覆盖伤口法，人工接种后3天，在番茄叶片上便能产生明显的病症，症状与猕猴桃寄主叶片病斑症状相似，在田间猕猴桃叶片及茎干不易获得的条件下，利用番茄叶片症状与猕猴桃叶片症状相似的特点，来测定病菌的致病力，番茄一年四季均可种植，来源方便，病菌接种番茄叶片后具有发病时间快、病症清楚。可随时满足新分离病菌及不同保存时间病菌的致病力快速检测需求，具有较好的适用性。附图说明图1为用于接种的番茄叶片；图2为针刺伤口上覆盖的病菌菌悬液液滴；图3为不同病菌在番茄叶片上接种4天后的病症表现，其中图3-a为Psafj02，图3-b为Psafj04，图3-c为Psafj08，图3-d为无菌水；图4为不同株的病菌菌株在猕猴桃叶片上接种4天后的病症表现，其中图4-a为Psafj02，图4-b为Psafj04，图4-c为Psafj08，图4-d为无菌水；图5不同培养基培养的病菌接种番茄叶片3天后的病症表现，其中图5-a为Psafj02在6种不同培养基的表现，图5-a中从左到右分别依次为采用1、2、3、4、5和6号培养基进行培养；图5-b为Psafj07在6种不同培养基的表现，从左到右分别依次为采用1、2、3、4、5和6号培养基进行培养；图6为接种到不同植株叶片后的病症表现，其中图6-a为采用1、2、3、4、5和6号培养基培养的Psafj02在番茄叶片上的表现，图6-b为采用1、2、4号培养基培养的Psafj02在猕猴桃叶片上的表现。具体实施方式本专利技术提供了一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法，包括如下步骤：1)在番茄植株的叶片上沿叶脉两侧各刺1个小孔，在所述小孔中接种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液，得到接种病菌的番茄植株；2)将所述步骤1)中接种病菌的番茄植株在20～30℃，相对湿度在75～90％的条件下生长3～4天后，在所述小孔周围测量叶肉组织变褐色部位的直径，依据褐色部位的直径判断致病力，当褐色部位的直径≤1.00mm，为弱致病力菌株；当1mm<褐色部位的直径≤2.50mm，为中等致病力菌株；当2.5mm<褐色部位的直径，为强致病力菌株。本专利技术在番茄植株叶片上沿叶脉两侧各刺1个小孔，在小孔中接种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液，得到接种后的番茄植株。本专利技术中，所述番茄植株叶片优选为番茄植株中上部的叶片，更优选为番茄植株中部的叶片。所述番茄植株叶片的叶龄优选为20～30d的健康叶片，更优选为25d的健康叶片。本专利技术对所述番茄植株的品种、来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本专利技术实施例中采用帝皇红樱桃，60d以上生育期，有6轮以上分枝，叶龄20～30d的番茄植株作为试验番茄植株，具体图1所示。本专利技术中，所述小孔的直径优选为4～6mm，更优选为5mm。所述刺小孔的工具优选为无菌针。本专利技术中，每一株猕猴桃细菌性溃疡病菌优选接种3颗番茄植株，每颗番茄植株至少接种4个叶片，每个叶片接2个小孔。所述猕猴桃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)在番茄植株的叶片上沿叶脉两侧各刺1个小孔，在所述小孔中接种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液，得到接种病菌的番茄植株；2)将所述步骤1)中接种病菌的番茄植株在20～30℃，相对湿度在75％～90％的条件下生长3～4天后，在所述小孔周围测量叶肉组织变褐色部位的直径，依据褐色部位的直径判断致病力，当褐色部位的直径≤1.00mm，为弱致病力菌株；当1mm

【技术特征摘要】
1.一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)在番茄植株的叶片上沿叶脉两侧各刺1个小孔，在所述小孔中接种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液，得到接种病菌的番茄植株；2)将所述步骤1)中接种病菌的番茄植株在20～30℃，相对湿度在75％～90％的条件下生长3～4天后，在所述小孔周围测量叶肉组织变褐色部位的直径，依据褐色部位的直径判断致病力，当褐色部位的直径≤1.00mm，为弱致病力菌株；当1mm<褐色部位的直径≤2.50mm，为中等致病力菌株；当2.5mm<褐色部位的直径，为强致病力菌株。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中猕猴桃细菌性溃疡病病菌菌悬液的浓度为5～10×108CFU/mL，猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液的接种量为30～40μL/孔。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中小孔的直径为4～6mm。4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中测量叶肉组织变褐色部位的直径的方法为十字交叉法。5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，每一株猕猴桃细菌性溃疡病菌接种3颗番茄植株，每颗番茄植株至少接种4个小孔。6.根据权利要求1或2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：何玉仙，杨秀娟，代玉立，兰成忠，卢学松，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35