扩增引物组、建库方法及SNP分型方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，提供了一种扩增引物组，用于制备扩增产物，所述扩增引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物从3’端至5’端依次包括扩增引物序列和锚定引物序列；所述扩增引物序列用于扩增含待测SNP位点的核酸片段；在扩增产物中，所述锚定引物序列用作测序引物，所述锚定引物序列及其锚定位置位于所述待测SNP位点的同一侧。本发明专利技术还提供了一种基于上述扩增引物组的建库方法和SNP分型方法。采用本发明专利技术的扩增引物组制备的文库分子，其上含有测序引物，在SNP分型过程中无需向体系中额外添加测序引物，避免了对多个样本进行测序时由于测序引物不同而产生的相互干扰，提高了测序效率和准确性。

Amplification primer group, database construction method and SNP typing method

The present invention relates to the field of molecular biology and provides an amplified primer set for the preparation of amplified products. The amplified primer set comprises a first primer and a second primer, the first primer from the 3'end to the 5'end in turn includes an amplified primer sequence and an anchored primer sequence; the amplified primer sequence is used for amplifying the SNP site to be determined. In the amplified product, the anchored primer sequence is used as a sequencing primer, and the anchored primer sequence and its anchor location are located on the same side of the SNP site to be measured. The invention also provides a method for building a database based on the amplified primer group and a SNP typing method. The library molecule prepared by the amplified primers group of the invention contains sequencing primers, and no additional sequencing primers need to be added to the system during the SNP typing process, thus avoiding the mutual interference caused by different sequencing primers in the sequencing of multiple samples and improving the sequencing efficiency and accuracy.

【技术实现步骤摘要】
扩增引物组、建库方法及SNP分型方法
本专利技术涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种扩增引物组、建库方法及SNP分型方法。
技术介绍
单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP）是指基因组上单个核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化，其数量很多，多态性丰富。SNP被认为是遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关，因此SNP的分型对诸多疾病的治疗和用药有着积极的意义。针对基因检测，二代高通量测序技术因其准确、灵敏的特性，应用范围不断扩大，已涉及生命科学研究以及医学研究的各个不同方面，利用二代高通量测序技术来进行SNP位点的检测也是目前的研究热点之一。但是，基于二代高通量测序技术的SNP分型方法，当同时对多个待测序样本进行检测时，需要向测序体系中加入多种测序引物，不同测序引物之间容易产生相互干扰，使得多位点测序准确性降低，从可能降低SNP分型检测的准确率。因此，需要一种新的扩增引物组、建库方法及SNP分型方法，能够避免在同一体系中同时对多个待测SNP位点进行检测时，不同测序引物之间相互干扰的现象。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种扩增引物组、建库方法及SNP分型方法，旨在解决现有技术在同一体系中同时对多个SNP位点检测时，不同测序引物之间相互干扰的问题。本专利技术的一个目的在于提出一种扩增引物组，用于制备扩增产物，所述扩增引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物从3’端至5’端依次包括扩增引物序列和锚定引物序列；所述扩增引物序列用于扩增含待测SNP位点的核酸片段；在扩增产物中，所述锚定引物序列用作测序引物，所述锚定引物序列及其锚定位置位于所述待测SNP位点的同一侧。优选的，所述第二引物上含有切割位点；所述切割位点为尿嘧啶或限制性内切酶切割位点。优选的，所述扩增引物序列长度为15至25bp；所述锚定引物序列长度为15至20bp。优选的，所述扩增引物序列锚定的退火温度为57至63℃；所述锚定引物序列锚定的退火温度为42至50℃。本专利技术的第二个目的在于提出一种建库方法，包括以下步骤：A、利用扩增引物组对含待测SNP位点的核酸片段进行PCR扩增，得到扩增产物；所述扩增物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物从3’端至5’端依次包括扩增引物序列和锚定引物序列；所述扩增引物序列用于扩增含待测SNP位点的核酸片段；在扩增产物中，所述锚定引物序列用作测序引物，所述锚定引物序列及其锚定位置位于所述待测SNP位点的同一侧；B、在扩增产物含锚定引物序列所在端的相对端上连接接头，得到文库分子。优选的，所述锚定引物序列的锚定位置与待测SNP位点之间的距离为1至5bp。优选的，所述第一引物的5’端含有尿嘧啶，所述步骤B还包括以下步骤：B0、采用特异性切割尿嘧啶的酶对扩增产物进行切割，得到第一切割产物。优选的，所述第二引物上含有切割位点，所述切割位点为尿嘧啶或限制性内切酶切割位点；所述步骤B包括以下步骤：B1、对第一切割产物进行切割，得到第二切割产物，所述第二切割产物上经酶切形成第一粘性末端；B2、在连接酶的作用下，所述第二切割产物在第一粘性末端处连接接头，得到文库分子；所述接头上含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。本专利技术的第三个目的在于提供一种SNP分型方法，包括对按上述任一种建库方法制得的文库分子进行测序的步骤。优选的，当检测的待测序样本有多个时，根据待测序样本的不同分别建库，获得多种文库分子，再将多种文库分子混合后进行测序。本专利技术的扩增引物组，通过对含待测SNP位点的核酸片段进行扩增，从而获得含待测SNP位点和测序引物的扩增产物。在对待测SNP位点进行测序的过程中，连接在待测模板链上的测序引物锚定在待测模板链上的锚定位置，测序引物的自由末端作为测序反应的起点，从而检测待测SNP位点的基因型。本专利技术无需额外向测序体系中添加测序引物，避免了对多个待测序样本同时进行测序时由于测序引物不同而产生的相互干扰，提高了测序的准确性；另外，测序引物的锚定位置与待测SNP位点之间的距离为1至5bp，只需进行较少次数的测序步骤即可完成检测，大大缩短了测序时间，且使对待测SNP位点的检测不受测序仪器读长的限制，提高了测序准确性。附图说明图1为本专利技术第一实施例中第一引物的结构示意图。图2为本专利技术第一实施例中的扩增示意图。图3为本专利技术第三实施例中以反向链为测序模板链时测序引物的锚定示意图。图4为本专利技术第三实施例中以正向链为测序模板链时测序引物的锚定示意图。图5为本专利技术第四实施例中各反应体系的扩增产物的Page胶电泳图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。本专利技术提出第一实施例，如图1、2所示，一种扩增引物组，用于制备扩增产物300，包括第一引物110和第二引物120，所述第一引物110从3’端至5’端依次包括扩增引物序列111和锚定引物序列112；所述扩增引物序列111用于扩增含待测SNP位点的核酸片段200；在扩增产物300中，所述锚定引物序列112用作测序引物，所述锚定引物序列112及其锚定位置311位于所述待测SNP位点312的同一侧。需要说明的是，本专利技术的第一引物110可以是上游引物，也可以是下游引物。本实施例中，如图2所示，第一引物110为下游引物，用于扩增核酸片段200的反向链220。在PCR扩增过程中，第一引物110上的扩增引物序列111结合在反向链220上，第二引物120结合在正向链上，经过PCR扩增得到扩增产物300。扩增产物300的正向链310上同时含有待测SNP位点312和锚定引物序列112，所述锚定引物序列112及其锚定位置311位于所述待测SNP位点312的同一侧；相应的，扩增产物300的反向链320上也含有与锚定引物序列112互补配对的配对序列113，配对序列113及其锚定位置321位于反向链待测SNP位点322的同一侧。采用本实施例的扩增引物组制备扩增产物，得到的扩增产物上含有锚定引物序列，在后续对待测SNP位点进行测序的步骤中，锚定引物序列可用作测序引物，从而无需额外添加测序引物，简化了后续的测序步骤，避免了同时进行多个样本测序时由于测序引物不同而产生的相互干扰，提高了测序效率和准确性。优选的，所述扩增引物序列长度为15至25bp；所述锚定引物序列长度为15至20bp。采用本方案的扩增引物进行PCR扩增，在具有较高的扩增效率的同时，其引入的测序引物在后续测序步骤中能够较好的锚定在其锚定位置上，从而使得其在后续测序步骤中，具有较高的测序效率。优选的，所述扩增引物序列锚定的退火温度为57至63℃；所述锚定引物序列在测序过程中锚定的退火温度为42至50℃。本方案的扩增引物组，能够通过将PCR反应过程中的退火温度控制在57至63℃范围，避免在PCR反应过程中锚定引物序列锚定在测序模板链上。需要说明的是，采用本实施例的扩增引物组制备的扩增产物300，其正向链310和反向链320均可以用作后续测序过程中的测序模板链。当以正向链310作为测序模板链时，锚定引物序列112锚定在其锚定位置311处，在后续测序过程中，需要通过在锚定引物序列112的5’末端进行磷酸化，然后在锚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扩增引物组，用于制备扩增产物，其特征在于，所述扩增引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物从3’端至5’端依次包括扩增引物序列和锚定引物序列；所述扩增引物序列用于扩增含待测SNP位点的核酸片段；在扩增产物中，所述锚定引物序列用作测序引物，所述锚定引物序列及其锚定位置位于所述待测SNP位点的同一侧。

【技术特征摘要】
1.一种扩增引物组，用于制备扩增产物，其特征在于，所述扩增引物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物从3’端至5’端依次包括扩增引物序列和锚定引物序列；所述扩增引物序列用于扩增含待测SNP位点的核酸片段；在扩增产物中，所述锚定引物序列用作测序引物，所述锚定引物序列及其锚定位置位于所述待测SNP位点的同一侧。2.根据权利要求1所述的扩增引物组，其特征在于，所述第二引物上含有切割位点；所述切割位点为尿嘧啶或限制性内切酶切割位点。3.根据权利要求1所述的扩增引物组，其特征在于，所述扩增引物序列长度为15至25bp；所述锚定引物序列长度为15至20bp。4.根据权利要求1所述的扩增引物组，其特征在于，所述扩增引物序列锚定的退火温度为57至63℃；所述锚定引物序列锚定的退火温度为42至50℃。5.一种建库方法，其特征在于，包括以下步骤：A、利用扩增引物组对含待测SNP位点的核酸片段进行PCR扩增，得到扩增产物；所述扩增物组包括第一引物和第二引物，所述第一引物从3’端至5’端依次包括扩增引物序列和锚定引物序列；所述扩增引物序列用于扩增含待测SNP位点的核酸片段；在扩增产物中，所述锚定引物序列用作测序引物，所述锚定引物序列及其...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，黄思强，
申请(专利权)人：广州康昕瑞基因健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44