薄壳山核桃品种Davis的特征序列、标记引物及鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一对特异性高的薄壳山核桃品种Davis的特征序列、分子特异性标记引物、以及一种能对薄壳山核桃品种Davis进行快速鉴定的方法。所述分子特异性标记引物序列如下：上游引物：5′‑TCCTGAAAGCAGCCACAACA‑3′；下游引物：5′‑GACATGTGTACGAGGTGGTCA‑3′。本发明专利技术分子特异性标记引物可对薄壳山核桃品种Davis进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别薄壳山核桃品种所不能替代的分子手段。

【技术实现步骤摘要】
薄壳山核桃品种Davis的特征序列、标记引物及鉴定方法
本专利技术涉及薄壳山核桃品种Davis的特征序列、分子特异性标记引物以及利用该分子特异性标记引物对薄壳山核桃品种Davis进行快速鉴定的方法。
技术介绍
薄壳山核桃（Caryaillinoënsis(Wangenh.)K.Koch）是胡桃科山核桃属中最有经济价值的树种。薄壳山核桃是典型的异交植物，现有生产实践发现，薄壳山核桃的品种配置是影响其产量主要因素之一。美国是薄壳山核桃的原产地之一，也是其中心产区，多年来，美国已选育命名的栽培品种约1000个。我国引种薄壳山核桃已有100多年历史，目前生产上常用的品种也有几十个，多年的生产实践已证明我国广大亚热带地区是薄壳山核桃的适生区；但是，现有我国薄壳山核桃产区面临的主要问题是产量低下和不稳定。造成这一现象原因有多个方面，其中之一就是现有引进的品种缺乏明确的亲缘关系分析，加上一些杂交后代定名的混乱，导致难以进行有效的亲本选择和合理配置，不便于品种鉴定、推广、交流及新品种的培育，因此着力从分子水平上开发出一些品种稳定、特异的DNA指纹标记才是实现薄壳山核桃品种准确快速鉴定的科学途径；国内外已报导了一些基于SSR分子标记的薄壳山核桃品种的鉴定和亲缘关系分析方法，但存在检测较为繁琐，结果不稳定的情况。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供薄壳山核桃品种Davis的特征序列、分子特异性标记引物以及利用该分子特异性标记引物对薄壳山核桃品种Davis进行快速鉴定的方法；本专利技术采用的技术方案是：薄壳山核桃品种Davis的特征序列，其序列如下：5’-AATTCTGTTAGGAATTTCCTGAAAGCAGCCACAACATATTGGCAAGGATATTTCTATGCAAAATAGTTATTGTGTTAAAATAAGGTCTCCATTAGATCGTGCACAGTAAAGACAGTAATATCAAACTAAAGTATATATATATACACTATTTCTTTTCTTTTCCCTCACCTAATTCCTTCATACTAATTAACCACATTTACACTTTTATTTGAAGAACATTAAAAGGTTATAATATTATCAAAATTATATAATATTATACTCTTTTTAAGGGGTTGTTTAGATTCAGAAACCATCTTATCTTATTTTATCTCATCTCATTATTATAACTGTATCAAATTTTTATACAAAATATAATGACCACCTCGTACACATGTCTTCGAATTATCATGTTTTGTCATGT-3’（SEQIDNo.1）本专利技术还涉及薄壳山核桃品种Davis的分子特异性标记引物，所述引物序列为：上游引物：5′-TCCTGAAAGCAGCCACAACA-3′；下游引物：5′-GACATGTGTACGAGGTGGTCA-3′；该对引物是采用PCR技术，从常见的24个品种中筛选形状差异较大的品种进行简化基因的测序和比较分析，经过大量筛选试验获得薄壳山核桃品种Davis的特异性DNA片段（SEQIDNo.1）之后，将该片段克隆测序，针对序列相差较大的基因片段设计了1000多对引物，在24个样品中进行筛选和验证，经过初筛和三次以上重复性取样的复筛，最终获得的分子特异性标记引物，以该特异性引物对薄壳山核桃品种进行PCR扩增，仅Davis可获得359bp大小的特异性片段（SEQIDNo.2），其他薄壳山核桃品种均不能获得特异性片段。需要说明的是，本专利技术分子特异性标记引物仅限于薄壳山核桃品种的鉴定，即待测样品仅限于薄壳山核桃；针对上述特征序列的部分序列设计的特异性引物扩增产物为359bp：5’-TCCTGAAAGCAGCCACAACATATTGGCAAGGATATTTCTATGCAAAATAGTTATTGTGTTAAAATAAGGTCTCCATTAGATCGTGCACAGTAAAGACAGTAATATCAAACTAAAGTATATATATATACACTATTTCTTTTCTTTTCCCTCACCTAATTCCTTCATACTAATTAACCACATTTACACTTTTATTTGAAGAACATTAAAAGGTTATAATATTATCAAAATTATATAATATTATACTCTTTTTAAGGGGTTGTTTAGATTCAGAAACCATCTTATCTTATTTTATCTCATCTCATTATTATAACTGTATCAAATTTTTATACAAAATATAATGACCACCTCGTACACATGTC-3’（SEQIDNo.2）；Davis是DavisNursery在美国的密西西比州实生树中选出的品种，于1918年发现，1921年发布，。树体高，生长势旺，不适合密植。雄花先熟型，花期中，雌花萼片长。属中果型，坚果外壳平滑，平均单果重8.0g左右，坚果椭圆形，顶端尖锐和底部圆尖；果仁背中脊细，主凹槽宽，基部裂隙不明；本专利技术还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对薄壳山核桃品种Davis进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测薄壳山核桃品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现359bp大小的DNA条带，则待测薄壳山核桃品种为薄壳山核桃品种Davis，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：上游引物：5′-TCCTGAAAGCAGCCACAACA-3′；下游引物：5′-GACATGTGTACGAGGTGGTCA-3′；本专利技术方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行；本专利技术方法比现有薄壳山核桃品种的SSR标记鉴定方法的可靠性提高了很多，而且不像SSR标记扩增后还需要达1-2bp分辨率的电泳分析或者测序，本方法只需在普通PCR后进行普通电泳判断条带的有无即可，此外，本专利技术方法由于高度的准确性和特异性，因此对样品的要求较低，叶片、幼芽等组织的DNA样品均可以满足品种鉴定的需要；优选的，本专利技术所述PCR扩增体系组成如下：PCRBuffer终浓度为1×dNTPs1mmol/LMgCl22.5mmol/LTaq酶1.0U/反应上、下游引物各0.4μM模板DNA60ng/反应余量为ddH2O；所述PCR扩增条件如下：94℃预变性300s后，95℃变性10s，56℃退火时间50s，72℃延伸40s，共循环30次，最后在72℃补平300s。终止温度为4℃；PCRBuffer终浓度为1×，是指PCRBuffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCRBuffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCRBuffer。10×PCRBuffer成分为：100mMTris-HCl（pH8.5）、500mMKCl、25mMMgCl2和1.0%Triton-X-100，溶剂为ddH2O；具体的，所述方法如下：（1）取待测薄壳山核桃叶片，加液氮磨碎，采用bioteke新型快速植物基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取待测薄壳山核桃叶片的基因组DNA；（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：PCR反应体系每15μL组成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.薄壳山核桃品种Davis的特征序列，其序列如下：5’‑AATTCTGTTAGGAATTTCCTGAAAGCAGCCACAACATATTGGCAAGGATATTTCTATGCAAAATAGTTATTGTGTTAAAATAAGGTCTCCATTAGATCGTGCACAGTAAAGACAGTAATATCAAACTAAAGTATATATATATACACTATTTCTTTTCTTTTCCCTCACCTAATTCCTTCATACTAATTAACCACATTTACACTTTTATTTGAAGAACATTAAAAGGTTATAATATTATCAAAATTATATAATATTATACTCTTTTTAAGGGGTTGTTTAGATTCAGAAACCATCTTATCTTATTTTATCTCATCTCATTATTATAACTGTATCAAATTTTTATACAAAATATAATGACCACCTCGTACACATGTCTTCGAATTATCATGTTTTGTCATGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.薄壳山核桃品种Davis的特征序列，其序列如下：5’-AATTCTGTTAGGAATTTCCTGAAAGCAGCCACAACATATTGGCAAGGATATTTCTATGCAAAATAGTTATTGTGTTAAAATAAGGTCTCCATTAGATCGTGCACAGTAAAGACAGTAATATCAAACTAAAGTATATATATATACACTATTTCTTTTCTTTTCCCTCACCTAATTCCTTCATACTAATTAACCACATTTACACTTTTATTTGAAGAACATTAAAAGGTTATAATATTATCAAAATTATATAATATTATACTCTTTTTAAGGGGTTGTTTAGATTCAGAAACCATCTTATCTTATTTTATCTCATCTCATTATTATAACTGTATCAAATTTTTATACAAAATATAATGACCACCTCGTACACATGTCTTCGAATTATCATGTTTTGTCATGT-3’。2.薄壳山核桃品种Davis的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：上游引物：5′-TCCTGAAAGCAGCCACAACA-3′；下游引物：5′-GACATGTGTACGAGGTGGTCA-3′。3.一种利用权利要求2所述的分子特异性标记引物对薄壳山核桃品种Davis进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测薄壳山核桃品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物8FDB行电泳检测，若电泳结果...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：浙江省林业科学研究院，周清，
类型：发明
国别省市：浙江,33