HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及HD细胞模型制造技术

本发明专利技术公开了HTT的CRISPR/Cas9‑gRNA打靶序列对、质粒及HD细胞模型，涉及生物技术领域。本发明专利技术的打靶序列对包括L序列和R序列，L序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，R序列的碱基序列对如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术的打靶质粒包括第一载体质粒和上述的打靶序列对，打靶序列对构建至第一载体质粒中。本发明专利技术的HD细胞模型由PolyQ Donor质粒以及上述打靶质粒共转染细胞而得。本发明专利技术以分化的神经元细胞为载体构建HD细胞模型，为探索mHtt蛋白在影响或改变分化的神经细胞内环境方面的研究、分化的神经元细胞内由mHtt蛋白引起的各种信号通路、代谢通路及胞内稳态的变化提供了研究平台。

CRISPR/Cas9-gRNA targeting sequence pairs, plasmids and HD cell models of HTT

The invention discloses CRISSPR/Cas9_gRNA targeting sequence pairs, plasmids and HD cell models of HTT, and relates to the field of biotechnology. The target sequence pairs of the invention include L sequence and R sequence, the base sequence of L sequence is shown as SEQ ID NO.1, and the base sequence pair of R sequence is shown as SEQ ID NO.2. The target plasmid of the invention comprises a first carrier plasmid and the target sequence pairs described above, and the target sequence pairs are constructed into the first carrier plasmid. The HD cell model of the invention is obtained by CO transfection of PolyQ Donor plasmid and the target plasmid. The present invention constructs a HD cell model with differentiated neural cells as carriers, and provides a research platform for exploring the effects of mHtt protein on the environment of differentiated neural cells, various signal pathways, metabolic pathways and intracellular homeostasis changes induced by mHtt protein in differentiated neural cells.

【技术实现步骤摘要】
HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及HD细胞模型
本专利技术涉及生物
，尤其是HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及HD细胞模型。
技术介绍
亨廷顿舞蹈病(Huntington’sdisease,HD)是一种常染色体显性遗传病，其主要病灶在脑部，尚不清楚其确切的发病机制。HD在临床上主要表现为进行性的运动、认知及精神障碍，但最终导致患者死亡的原因大多都是并发症引起的。目前还没有有效的针对HD的治疗药物和方法，针对HD的治疗主要以缓解病症为主。在疾病的早期、病症不足以影响患者的日常生活时，通常是不需要药物的干预。当患者出现跌倒时，就要考虑药物干预治疗了，首选是多巴胺的消耗药物：四苯喹嗪，虽然其可能完全抑制过度运动，并可以有效地抑制HD的舞蹈样运动，但四苯喹嗪有加重HD患者抑郁的副作用。另外一方面，当患者出现严重的抑郁时，通常会首选抗抑郁的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂西酞普兰。针对HD患者的药物选择要根据患者当前的症状做出不断的调整。根据现在对HD的研究进展，研究者们正在尝试着不同治疗方式的探索。从最新的分子生物学
大致可分为两个方向的探索：第一，试图利用最新基因编辑工具实现对病灶部位组织进行原位病态基因组DNA的纠正；第二、试图将源于病灶的组织细胞在体外进行基因纠正之后再重新输入到患者的病灶部位以期望再次输入的正常细胞能够改善或治愈病灶。CRISPR-Cas9(ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsCRISPR-associatedCas9)系统是第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(Zincfingerendonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)都可用于各种复杂基因组的定点编辑。改造后的CRISPR/Cas9载体是由gRNA作为引导序列与所编辑DNA以碱基互补配对的方式相结合，这样的方式极大的降低了脱靶的概率，然后gRNA的发卡结构所携带的Cas9蛋白在PAM的作用下识别相应碱基序列，切断DNA双链或单链。基于此种原理，CRISPR/Cas9基因编辑系统相对于稍早的RNAi、Cre/LoxP、ZFN和TALEN系统，具有操作简单方便、效率高、成本低、同时沉默/敲出/突变任意数量的基因等优点。基于CRISPR/Cas9技术的发展，有研究者利用CRISPR/Cas9技术已经完成了载体细胞HEK293和293FHD模型的构建。也有研究者利用CRISPR/Cas9成功的在YAC128转基因HD小鼠模型中实现了对mHTT基因表达的沉默以及基于HD140Q-KI小鼠模型应用CRISPR/Cas9技术成功下调了mHtt在小鼠纹状体细胞中的表达量。说明CRISPR/Cas9在针对HD的模型构建和疾病发展的干预都有比较好的前景。目前，基于iPSCs和ESCs的HD细胞模型研究较多，但还没有基于分化神经细胞构建HD细胞模型的实验报道。基于iPSCs和ESCs的HD细胞模型研究的主要目的是试图将源于病灶的组织细胞在体外进行基因纠正之后再重新输入到患者的病灶部位以期望再次输入的正常细胞能够改善或治愈病灶(目前还没有试验成功的相关报道)。iPSCs和ESCs的HD细胞模型并不能完整反映HD的发病过程、及其发病过程中分化(功能)神经元细胞的内环境变化情况。又因HD是慢性的突变蛋白大量累积后才出现的严重神经疾病症状，其发病需要很长时间突变蛋白的积累且发病后患者一般会有15-20年的生存期，所以iPSCs和ESCs的HD细胞模型的实际应用受到了限制。
技术实现思路
本专利技术的第一专利技术目的在于：针对上述存在的问题，提供一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对，该序列对在体外以及细胞内对HTT具有剪切活性，为HTT的编辑以及HD的基因治疗的研究提供进一步地依据。本专利技术的第二专利技术目的在于，提供一种含有上述打靶序列对的打靶质粒，该打靶质粒将上述打靶序列对转染进细胞发挥基因编辑活性。本专利技术的第三专利技术目的在于，提供一种HD细胞模型，该细胞模型基于分化的神经元细胞，可以清晰地跟踪离体细胞HD发展的过程及其胞内环境的变化，提供了一种优良的用于改善和治疗HD疾病的药物或治疗方式的筛选平台。本专利技术采用的技术方案如下：一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对，其包括L序列和R序列，所述L序列的碱基序列如SEQIDNO.1所示，所述R序列的碱基序列对如SEQIDNO.2所示。本专利技术的一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，其包括第一载体质粒和上述的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对，所述HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对构建至所述第一载体质粒中。本专利技术的一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，其特征在于，所述载体质粒为VK001-05。一种HD细胞模型，其由PolyQDonor质粒以及上述的打靶质粒共转染细胞而得。本专利技术的一种HD细胞模型，所述PolyQDonor质粒由PolyQ基因片段构建到Donor骨架质粒而成。本专利技术的一种HD细胞模型，所述PolyQ基因片段选自Htt150Q、Htt90Q、Htt50Q或Htt20Q中的一种，其中Htt150Q的碱基序列如SEQIDNO.3所示，Htt90Q的碱基序列如SEQIDNO.4所示，Htt50Q的碱基序列如SEQIDNO.5所示，Htt20Q的碱基序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术的一种HD细胞模型，所述PolyQ基因片段前端和后端分别带有EcoRI和-XmaI酶切位点。本专利技术的一种HD细胞模型，所述PolyQDonor质粒使用Not1限制性内切酶酶切成线性质粒，线性质粒与上述的打靶质粒共转染细胞。本专利技术的一种HD细胞模型，转染时，PolyQDonor质粒以及打靶质粒用转染试剂进行包裹，PolyQDonor质粒与打靶质粒的总质量与转染试剂之间的比例为1:2-5(μg:μL)，PolyQDonor质粒与打靶质粒之间的质量比0.5-2:1。本专利技术的一种HD细胞模型，其特征在于所述细胞为CATH-a细胞。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：本专利技术根据HTT基因设计出一系列CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列，经过体外活性检测后，筛选出体外酶切活性均大于95％的Htt-L9和Htt-R9序列，将其配对后构建到VK001-05为载体得到Htt9号打靶质粒，该打靶质粒在细胞内具有良好的基因编辑活性。本专利技术还根据Htt-L9和Htt-R9基因组上的相对位置及其周围的碱基特性，设计并合成构建了四种长度的PolyQ基因片段，PolyQ基因片段具有EcoR1和Xma1双酶切位点，以便于将其段构建到Donor骨架质粒，得到NQDonor质粒。同时，PolyQ基因片段含有双Not1酶切位点，以使NQDonor质粒线性化。用Htt9号打靶质粒和线性NQDonor质粒共转染细胞，成功将NQ敲入细胞基因组，随后进行单克隆细胞筛选实验，最终获得了不同长度NQ敲入的单克隆细胞，成功构建了H本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HTT的CRISPR/Cas9‑gRNA打靶序列对，其特征在于，其包括L序列和R序列，所述L序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述R序列的碱基序列对如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对，其特征在于，其包括L序列和R序列，所述L序列的碱基序列如SEQIDNO.1所示，所述R序列的碱基序列对如SEQIDNO.2所示。2.一种HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，其特征在于，其包括第一载体质粒和权利要求1所述的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对，所述HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对构建至所述第一载体质粒中。3.根据权利要求2所述的HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒，其特征在于，其特征在于，所述载体质粒为VK001-05。4.一种HD细胞模型，其特征在于，其由PolyQDonor质粒以及权利要求2或3所述的打靶质粒共转染细胞而得。5.根据权利要求4所述的HD细胞模型，其特征在于，所述PolyQDonor质粒由PolyQ基因片段构建到Donor骨架质粒而成。6.根据权利要求5所述的HD细胞模型，其特征在于，所述PolyQ基因片段选自Htt150Q、Htt90...

【专利技术属性】
技术研发人员：付彬，徐兴然，彭怡，王柏彬，杨春丽，吴惠，杨丹，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50