大片段基因组的捕获探针的制备方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种大片段区域基因组的捕获探针的制备方法，其包括：设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增；将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将混合物破碎成规定片段；在规定片段的两端接上含有RNA聚合酶识别序列的接头，构建成文库；使用RNA聚合酶将所得到的文库中的片段转录成RNA产物；加入DNA消化酶，将RNA产物中的DNA链消化；并且消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针。在本发明专利技术中，采用将待捕获区域基因的扩增产物破碎成规定片段，经过后续反应得到适合长度的基因探针(RNA探针)。这个长度范围的RNA不易自我退火形成二级结构，使用探针时结合效率较高。由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，实现了更高的灵敏度。

Preparation method and kit of capture probes for large fragment genome

The invention provides a method for preparing a capture probe for a large fragment region genome, which includes: designing a PCR primer to amplify the captured genome by PCR reaction; mixing the PCR products produced in the PCR reaction into a mixture and breaking the mixture into a prescribed fragment; and containing RNA polymerization at both ends of the prescribed fragment. Enzyme recognizes the junction of the sequence and constructs a library; uses RNA polymerase to transcribe the fragments from the library into RNA products; adds DNA digestive enzymes to digest the DNA strands in the RNA products; and the digested products are purified and processed to obtain the captured gene probe. In the invention, the amplified product of the gene in the region to be captured is broken into a prescribed fragment, and a gene probe (RNA probe) of suitable length is obtained by subsequent reaction. The RNA of this length range is not easy to self anneal to form a two level structure. Thus, it can achieve better sensitivity and better fault tolerance while ensuring specificity.

【技术实现步骤摘要】
大片段基因组的捕获探针的制备方法及试剂盒
本专利技术涉及生物样品的制备和处理，更具体而言，涉及一种大片段基因组的捕获探针的制备方法及试剂盒。
技术介绍
高通量测序技术自2005年诞生以来，展示了广阔的应用前景。通过测序科学家可以看到单核苷酸多态性、突变热点、基因组结构变异、群体多态性等重要信息。而在很多研究中，并不需要对全基因组进行测序，全基因组测序数据要求大，并非适合所有应用领域。因此在生化方法领域，产生了很多靶区域测序的捕获方法，这其中主要以探针捕获和多重PCR两种方法为主。探针捕获适合制作长而大的基因组区域，而多重PCR适合制作小区域。在探针捕获领域，已经开发了有很多制备探针的方法。典型地，以罗氏公司的芯片捕获DNA探针合成以及安捷伦公司的RNA探针合成为主。DNA探针的刚性强，探针对应区域如果有大片段的插入或缺失则较难捕获下来。虽然短片段DNA探针的化学合成成本很低，但随着片段长度的增加，化学合成方法的成本会显著增加。安捷伦开创的RNA杂交捕获探针是长度统一的120mer的单一靶标特异性RNA探针，但定制性捕获价格较高。专利文献1(公开号为105506035A)公开了一种RNA探针制备的方法。具体而言，在专利文献1中，该方法以所述多重DNA片段为模板，加入RNA聚合酶和带有生物素或荧光标记的biotin-dUTP进行反应，将UTP参入产物，纯化后得到RNA探针。最终得到的RNA探针是100-500mer长度的RNA探针。然而，这些RNA探针中部分探针长度过长，在过量的环境下容易自我退火形成二级结构，使得探针在使用时结合效率降低。然而，在上述专利文献中，需要扩增产物构建载体，然后再用构建的克隆载体为对象，进行基因探针制备，不适合大量区域的捕获。此外，也有一些文献公开了其他基因探针制备的方法，包括如下几种：(1)在PCR后直接加接头，也是小区域片段，且并没有将转录后残留的DNA去除；(2)需要合成DNA探针，因此合成成本会较高，而且制备单链时需要单向扩增，这种扩增方法属于线性扩增，效率通常较差；(3)制备单链需要经过多次试验后外切酶水解，步骤较多，会产生一定的偏差，同时酶效率也会影响探针的制备质量。
技术实现思路
本专利技术是鉴于上述现有的状况而完成的，其目的在于提供一种能够在使用探针时改善结合效率的大片段区域基因组捕获探针的制备方法。为此，本专利技术的一方面提供了一种大片段区域基因组捕获探针的制备方法，其包括：设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增；将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将所述混合物破碎成规定片段；在所述规定片段的两端接上含有RNA聚合酶识别序列的接头，构建成文库；使用RNA聚合酶将所得到的所述文库中的片段转录成RNA产物；加入DNA消化酶，将所述RNA产物中的DNA链消化；并且消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针。在本专利技术的一方面中，采用将待捕获大片段区域基因的扩增产物破碎成规定片段，经过后续反应得到适合长度的基因探针(RNA探针)。这个长度范围的RNA不易自我退火形成二级结构，使用探针时结合效率较高。由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，实现了更高的灵敏度。另外，在本专利技术的一方面所涉及的制备方法中，所述RNA聚合酶可识别启动子序列包括T7启动子序列。在这种情况下，T7RNA启动子能够高效率的促使RNA聚合酶转录RNA。另外，在本专利技术的一方面所涉及的制备方法中，所述待捕获基因组的长度为200bp-10kb。通过将待捕获基因组的长度控制在适当的长度范围，由此能够更加容易地得到期望长度的基因探针。另外，在本专利技术的一方面所涉及的制备方法中，所述混合物由PCR产物按照等分子量混合而成。在这种情况下，能够更加容易地调配混合物的成分比例。另外，在本专利技术的一方面所涉及的制备方法中，所述规定片段为150bp-300bp的基因片段。在这种情况下，能够控制后续所形成的基因探针的长度，例如为150-300mer。这个上述长度范围的RNA不易自我退火形成二级结构，使用探针时结合效率较高，由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，实现更高的灵敏度。另外，在本专利技术的一方面所涉及的制备方法中，在所述规定片段两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库的步骤包括：使用不具有3'到5'外切酶活性的DNA聚合酶对所述规定片段进行加A处理，形成中间片段；使用DNA连接酶将所述中间片段接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，形成接头片段；并且根据接头序列设计接头引物对所述接头片段进行PCR扩增以构建文库，在所述PCR扩增中使用的dNTP包含biotin-dUTP，且biotin-dUTP与dTTP比率(biotin-dUTP:dTTP)为1:1～5:1。另外，在本专利技术的一方面所涉及的制备方法中，在所述规定片段两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库的步骤包括：使用不具有3'到5'外切酶活性的DNA聚合酶对所述规定片段进行加A处理，形成中间片段；用DNA连接酶将所述中间片段接上含有T7RNA聚合酶识别序列的接头；并且使用试剂盒进行文库构建。另外，在本专利技术的一方面所涉及的制备方法中，所述DNA消化酶为USER酶。另外，在本专利技术的一方面所涉及的制备方法中，所述DNA消化酶为脱氧核糖核酸酶(DNaseI)。本专利技术的另一方面提供了一种试剂盒，其包括根据权利要求1至9中的任一项所述的制备方法所制备的基因探针。该试剂盒可以用于大片段基因组的捕获。根据本专利技术，能够提供一种能够在使用探针时改善结合效率的大片段区域基因组捕获探针的制备方法及试剂盒。附图说明图1是示出了本专利技术的实施方式所涉及的大片段基因组捕获探针的制备方法的流程图。图2是示出了以大片段基因组为模板的RNA探针的制备过程的流程图。具体实施方式以下，参考附图，详细地说明本专利技术的优选实施方式。在下面的说明中，对于相同的部件赋予相同的符号，省略重复的说明。另外，附图只是示意性的图，部件相互之间的尺寸的比例或者部件的形状等可以与实际的不同。图1是示出了本专利技术的实施方式所涉及的大片段基因组捕获探针的制备方法的流程图。图2是示出了以大片段基因组为模板的RNA探针的制备过程的流程图。本实施方式所涉及的大片段区域基因组捕获探针的制备方法，包括：设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增(步骤S10)；将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将混合物破碎成规定片段(步骤S20)；在规定片段的两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库(步骤S30)；使用RNA聚合酶将所得到的文库中的片段逆转录成RNA产物(步骤S40)；加入DNA消化酶，将RNA产物中的DNA链消化(步骤S50)；并且消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针(步骤S60)。在本实施方式所涉及的制备方法中，采用将待捕获大片段区域基因的扩增产物破碎成规定片段，经过后续反应得到适合长度的基因探针(RNA探针)。这个长度范围的RNA不易自我退火形成二级结构，使得使用探针时结合效率较高。由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，既可以捕获单碱基突变，又可以捕获插入或缺失突变，更少地丢失目标序列，实现了更高的灵敏度。在步骤S10中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大片段基因组的捕获探针的制备方法，其特征在于，包括：设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增；将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将所述混合物破碎成规定片段；在所述规定片段的两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库；使用RNA聚合酶将所得到的所述文库中的片段转录成RNA产物；加入DNA消化酶，将所述RNA产物中的DNA链消化；并且消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针。

【技术特征摘要】
2017.12.30 CN 20171149044331.一种大片段基因组的捕获探针的制备方法，其特征在于，包括：设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增；将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将所述混合物破碎成规定片段；在所述规定片段的两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库；使用RNA聚合酶将所得到的所述文库中的片段转录成RNA产物；加入DNA消化酶，将所述RNA产物中的DNA链消化；并且消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述RNA聚合酶可识别启动子序列包括T7启动子序列。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述待捕获基因组的长度为200bp-10kb。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合物由PCR产物按照等分子量混合而成。5.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述规定片段为150bp-300bp的基因片段。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述规定片段两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨吉元，杨骁，
申请(专利权)人：深圳人体密码基因科技有限公司，上海何因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44