一种遗传分析仪测试专用等位基因标准对照试剂制备方法技术

本发明专利技术公开了一种遗传分析仪测试专用等位基因标准对照试剂制备方法，包括：1)进行特定数量生物样本的获取；2)PCR法获得指定位点的系列等位基因；3)核心序列定点突变；4)获得指定位点全部基因克隆载体；5)设计并合成荧光引物；6)等位基因克隆载体浓度条件摸索并进行调平测试；6)多模板荧光复合扩增并检测；7)等位基因标准物扩增制备、纯化、保存。本发明专利技术采用克隆技术将特定STR位点系的列等位基因克隆进入选定克隆载体，进而通过多模板复合扩增技术对上述载体进行荧光扩增，实现等位基因标准对照试剂的可持续性制备。

【技术实现步骤摘要】
一种遗传分析仪测试专用等位基因标准对照试剂制备方法
本专利技术涉及DNA检验
，具体涉及一种遗传分析仪测试专用等位基因标准对照试剂制备方法。
技术介绍
DNA检验技术，特别是基于STR-PCR的DNA检验技术经过多年的发展，已被广泛用于个体识别和亲缘关系认定。基于DNA检验技术特有的技术优势，其已经成为我国公安机关侦查破案、打击犯罪的一把利剑，法庭科学领域无可争议的证据之王。同时也被广泛应用于民事案件、大型灾难性事故及群体性突发事件中的个体识别。近年来，基于多态性的短串联重复序列进行不同个体区分及识别已经成为当前法医DNA检测及个体识别的主流DNA分型技术。特别是最近发展起来多位点荧光STR复合扩增技术具有高效、快速、灵敏度高等优点，已在个人识别、亲权鉴定中发挥了相当重要作用。然而，这项技术的应用必须以相应的检验设备平台和检验试剂作为有效支撑。我国法医DNA分析技术起步较早，早在1985年国际上首次报道DNA指纹技术应用于法医鉴定以来，我国法庭科学工作者就一直致力于DNA检验技术研究工作，在DNA检验试剂、提取方法等方面获得了重要成果，实现了国产化。然而，在检验设备平台方面一直依赖进口，形成了对国外产品的高度依赖。迫于上述现状，我国在“十一五”期间启动了基于激光诱导荧光检测技术的多通道毛细管遗传分析仪的研制。在研究期间，攻克多项关键技术，最终实现了该仪器平台的国产化，并迅速推广应用到多家公安机关DNA实验室。国产遗传分析仪的研制成功，是我国法医DNA检验
的一项重大突破和创新，打破国外在这个领域长期技术和市场垄断，满足了我国公安机关刑事案件DNA检验和数据库建设等工作的需要，对推动公安科技进步、降低DNA检验成本起到非常重大的作用。随着我国法医DNA检验技术的快速发展，遗传分析仪国产化进程加快推进，法医DNA检验领域对国产遗传分析仪需求日益增加，这势必对国产化DNA检验设备量产后的质量控制及新型号设备性能评价能力提出更高要求。遗传分析仪测试标准对照试剂通常是由多个不同长度荧光标记DNA混合物组成，是遗传分析仪验证、检测和测试的必备试剂之一。标准试剂对于遗传分析仪的质量控制和性能测试十分重要，是评价和分析遗传分析仪分型准确性、重复性、筛分精确度、灵敏度等性能指标的重要介质。通过分析标准品在遗传分析仪上电泳分离结果，可对设备的DNA筛分能力、检测灵敏度、信噪比、检验重复性(不同组之间和不同孔之间)、荧光检测性能等多项指标形成系统、客观的评估结果，从而满足遗传分析仪的质量控制、性能测试、新设备研发测试等要求。当前市场上不存在商品化的遗传分析仪测试标准品，目前，通常用商品化等位基因标准物作为测试标准品使用。市场上有多种商品化等位基因分型标准物可供选择。然而，主要的分型标准物主要还要依靠外国几家大公司进口，价格昂贵，试剂消耗量大，无疑大幅增加了仪器生产成本，并且仅提供等位基因分型标准物是针对进口设备进行相关激光激发和信号采集情况进行调配，荧光选择、标准物浓度等均并不能满足国产设备平台测试要求，不利于设备质量控制体系及验证测试体系的建立。目前常用的制备测试标准参照物的方法总称为荧光PCR扩增法，主要的有：1)混合不同基因型的模板DNA，PCR扩增，筛选出含有不同长度待扩增目的片段的样本，进行基因组DNA提取，调整各基因组DNA的终浓度达到一致，取等体积混合，设计荧光标记PCR引物并对混合模板进行扩增，经模板浓度微调整后，其扩增产物可以作为标准品使用；2)不同长度的荧光PCR产物混合作为分型标准物质，即通过混合并调配各PCR单模板扩增产物浓度进行标准品的制备；3)二次扩增法，就是将已经调平扩增产物作为DNA模板进行再扩增进行标准品的制备。将含有标准品物作为模板，稀释103至107倍后再次扩增。现有制备方法的主要缺点如下：1、前期样本容易受制于前期批量样本采集、检验、筛选的环节，包括样本收集工作量大，耗费时间长，分型检验消耗费用大，导致整体制备环节耗时长，效率低下。2、制备的标准品的特征和性能必须依赖于相关样本序列特性，缺乏灵活度，难以达到制备高质量、高标准、高灵活度的测试标准品的制备要求。3、操作繁琐，调平难度大4、标准对照试剂质量难以控制5、对样本依赖性强，无法实现可持续性获取，极大增加生产过程工作量。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种遗传分析仪测试专用等位基因标准对照试剂制备方法，采用克隆技术将特定STR位点系的列等位基因克隆进入选定克隆载体，进而通过多模板复合扩增技术对上述载体进行荧光扩增，实现等位基因标准对照试剂的可持续性制备。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种遗传分析仪测试专用等位基因标准对照试剂制备方法，包括如下步骤：S1进行大量群体样本的采集，获得设定数量人群的血液或唾液样本；S2对步骤S1中采集得到的全体样本进行STR分型检测，确定每个样本的STR分型；S3根据步骤S2中得到的STR分型结果挑选包含相应分型等位基因的样本；S4等位基因克隆库的建立：在步骤S3所挑选得到的样本中，对于等位基因齐全的基因座采用直接克隆的方式获得全部等位基因的克隆，对于等位基因不全的位点采取先克隆后定点突变的方法进行等位基因克隆库的建立；S5等位基因克隆库建立后，开始荧光标准物的制备：首先设计、合成筛选出相应位点的特异性荧光引物，系列稀释所选取的质粒DNA，并进行荧光PCR扩增以摸索质粒DNA的最适浓度，之后进行模板混合调平，确定各质粒DNA的浓度后，进行多模板荧光复合PCR扩增并检测，经检验后进行纯化并分装保存。需要说明的是，步骤S4中，所述对于等位基因齐全的基因座采用直接克隆的方式获得全部等位基因的克隆，具体过程如下：4.1.1)设计引物对筛选出的纯合子进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，染色，产物胶回收纯化后将其插入质粒载体中；4.1.2)将重组质粒导入大肠杆菌，培养大肠杆菌，从而获得单一DNA分子的大量拷贝；4.1.3)测序并筛选序列正确的阳性克隆并用质粒通用引物对重组质粒进行DNA测序分析，证实插入片段的序列信息，按重复单位的重复次数对插入的等位基因片段进行分类，建立包含不同长度的等位基因克隆库。需要说明的是，步骤S4中，所述对于等位基因不全的位点采取先克隆后定点突变的方法进行等位基因克隆库的建立，具体过程如下：4.2.1)设计克隆引物对挑选出的分型样本进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，染色，产物胶回收纯化后将其插入质粒载体中；4.2.2)将重组质粒导入大肠杆菌，培养大肠杆菌，从而获得单一DNA分子的大量拷贝；4.2.3)测序并筛选序列正确的阳性克隆并用质粒通用引物对重组质粒进行DNA测序，分析证实插入片段的序列信息，按重复单位的重复次数对插入的等位基因片段进行分类，然后采用核心序列定点突变技术，获得一系列指定核心序列重复次数的不同等位基因克隆，继而建立该位点全部等位基因克隆库。需要说明的是，步骤S5中，所述进行荧光PCR扩增以摸索质粒DNA最适浓度的具体流程为：采用0.2uM所述特异性荧光引物对不同浓度的质粒DNA进行扩增，采用遗传分析仪对扩增产物进行检测，采用genemapper软件进行分析，所述质粒DNA的最适浓度应当满足所获得的分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种遗传分析仪测试专用等位基因标准对照试剂制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1进行大量群体样本的采集，获得设定数量人群的血液或唾液样本；S2对步骤S1中采集得到的全体样本进行STR分型检测，确定每个样本的STR分型；S3根据步骤S2中得到的STR分型结果挑选包含相应分型等位基因的样本；S4等位基因克隆库的建立：在步骤S3所挑选得到的样本中，对于等位基因齐全的基因座采用直接克隆的方式获得全部等位基因的克隆，对于等位基因不全的位点采取先克隆后定点突变的方法进行等位基因克隆库的建立；S5等位基因克隆库建立后，开始荧光标准物的制备：首先设计、合成筛选出相应位点的特异性荧光引物，系列稀释所选取的质粒DNA，并进行荧光PCR扩增以摸索质粒DNA的最适浓度，之后进行模板混合调平，确定各质粒DNA的浓度后，进行多模板荧光复合PCR扩增并检测，经检验后进行纯化并分装保存。

【技术特征摘要】
1.一种遗传分析仪测试专用等位基因标准对照试剂制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1进行大量群体样本的采集，获得设定数量人群的血液或唾液样本；S2对步骤S1中采集得到的全体样本进行STR分型检测，确定每个样本的STR分型；S3根据步骤S2中得到的STR分型结果挑选包含相应分型等位基因的样本；S4等位基因克隆库的建立：在步骤S3所挑选得到的样本中，对于等位基因齐全的基因座采用直接克隆的方式获得全部等位基因的克隆，对于等位基因不全的位点采取先克隆后定点突变的方法进行等位基因克隆库的建立；S5等位基因克隆库建立后，开始荧光标准物的制备：首先设计、合成筛选出相应位点的特异性荧光引物，系列稀释所选取的质粒DNA，并进行荧光PCR扩增以摸索质粒DNA的最适浓度，之后进行模板混合调平，确定各质粒DNA的浓度后，进行多模板荧光复合PCR扩增并检测，经检验后进行纯化并分装保存。2.根据权利要求1所述的遗传分析仪测试专用等位基因标准对照试剂制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述对于等位基因齐全的基因座采用直接克隆的方式获得全部等位基因的克隆，具体过程如下：4.1.1)设计引物对筛选出的纯合子进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，染色，产物胶回收纯化后将其插入质粒载体中；4.1.2)将重组质粒导入大肠杆菌，培养大肠杆菌，从而获得单一DNA分子的大量拷贝；4.1.3)测序并筛选序列正确的阳性克隆并用质粒通用引物对重组质粒进行DNA测序分...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜伯玮，荣海博，管桦，张涛，金川，
申请(专利权)人：公安部第一研究所，北京中盾安民分析技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11