本发明专利技术公开了一种用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物及筛选方法，涉及分子生物学领域。本发明专利技术主要采用SLAF‑seq技术和KASP技术对海胆生长性状进行相关的SNP标记，此SNP标记适用于中间球海胆早期辅助选种。本发明专利技术通过SLAF‑seq技术使高深度测序保证分型准确、简化的策略降低测序成本、前期简化方案预测保障标记数量最优，通过KASP技术使操作时间和步骤均有所简化，降低了成本。
【技术实现步骤摘要】
用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物及筛选方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物及筛选方法。
技术介绍
目前，对于中间球海胆的育种大多采用杂交育种、选择育种等传统的育种方法，无论是杂交育种还是选择育种，均是以生长性状良好的海胆为标准选择亲本。这些方法均需要在海胆的生长过程中，定期对其生长性状(壳高、壳径、体重)进行测量，并以此作为逐级筛选的标准，这些选择方式不仅耗费大量的人力物力，同时还会因亲本的基因并不是优良基因而导致优良基因型的子代苗种产出量低下。而分子标记辅助育种可提高选种过程的效率，可减少不良基因对选种的影响。常亚青在早期筛选中间球海胆良种的SNP引物及筛选方法中，采用HRM技术对海胆特定SNP位点基因型的筛选进行分子辅助育种，但该方法仅涉及到一个与生长性状相关的SNP位点检测，对于控制数量性状的优良基因而言检测的位点较少，在应用中有一定局限性。
技术实现思路
为解决现有技术的问题，本专利技术基于KASP技术提供一种与中间球海胆生长性状相关的SNP标记及其开发方法，此SNP标记适用于中间球海胆早期辅助选种。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：本专利技术提供一种用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种的引物，所述引物选自如下的KASP引物组：(1)SNP名称Marker49152，标记名称A007402，其对应的引物序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；(2)SNP名称Marker112898，标记名称A007399，其对应的引物序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；(3)SNP名称Marker140758，标记名称A007397，其对应的引物序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示；(4)SNP名称Marker63934，标记名称A007389，其对应的引物序列如SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；(5)SNP名称Marker203513，标记名称A007388，其对应的引物序列如SEQIDNO.13、SEQIDNO.14和SEQIDNO.15所示；(6)SNP名称Marker24433，标记名称A007376，其对应的引物序列如SEQIDNO.16、SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示；(7)SNP名称Marker72763，标记名称A007374，其对应的引物序列如SEQIDNO.19、SEQIDNO.20和SEQIDNO.21所示；(8)SNP名称Marker23360，标记名称A007366，其对应的引物序列如SEQIDNO.22、SEQIDNO.23和SEQIDNO.24所示；(9)SNP名称Marker13442，标记名称A007362，其对应的引物序列如SEQIDNO.25、SEQIDNO.26和SEQIDNO.27所示；(10)SNP名称Marker6879，标记名称A007358，其对应的引物序列如SEQIDNO.28、SEQIDNO.29和SEQIDNO.30所示。本专利技术还提供一种利用上述引物用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种筛选方法，包括以下步骤：(1)利用中间球海胆已建立的遗传图谱，根据QTL定位结果，从中筛选出与生长性状相关的SLAF标签，再从与生长性状相关的SLAF标签中挑选出可用于设计KASP引物的SLAF标签。本专利技术利用SLAF-seq技术对中间球海胆进行基因测序，在测序中获得大量的SLAF标签，SLAF标签可用于构建遗传图谱，利用遗传图谱与中间球海胆表型性状(壳高、壳径、体重)进行关联分析，进行QTL定位，通过对目的性状(壳高、壳径、体重)的QTL筛选，可回推出与生长性状(壳高、壳径、体重)相关的SLAF标签。由于SLAF标签的序列是由基因组简化测序而来，并经聚类分析后得到了2-3条tag序列，SLAF标签的序列可直接显示出SNP位点的碱基类型。(2)在可用于设计KASP引物的SLAF标签中能找到设计KASP引物的SNP位点，即多态性SNP标记，并利用AlleleSpecific(正向)引物和Reverse(反向)引物进行PCR扩增，对获得的PCR产物进行FAM和VIC荧光扫描分型，根据荧光分型结果可对设计的KASP引物进行验证。同时KASP标记在验证群体的检测结果会以文字形式给出每个标记在每个个体中的具体碱基类型，当SNP位点基因型能分为2-3种时，表明设计的KASP引物能进行SNP位点基因分型。(3)用KASP引物组对验证群体的DNA在LCGSNPline分型平台上进行基因分型验证，最终获得可对候选SNP位点进行准确分型的KASP引物组，即得到与生长性状相关的KASP标记。(4)根据验证群体生长性状的表型数据(壳高、壳径、体重)及与生长性状相关的KASP标记分型结果，对每个生长性状(壳高、壳径、体重)使用线性模型单独分析每个标记与表型数据的关联性，对每个生长性状使用P<0.05的显著关联标记和表型数据建立线性模型，然后使用stepwiseAIC对线性模型进行优化，获得与生长性状显著关联的分子标记(P<0.1)，最终得到每个生长性状的预测模型。在获得每个性状的预测模型后，将每个生长性状的预测值压缩到了0-1的区间以方便个体性状综合预测值计算，按照各性状所占权重，最终建立海胆的分子标记生长预测模型及海胆综合性状预测值公式。根据上文技术方案，优选的情况下，所述生长性状包括壳高、壳径、体重。本专利技术所述的体重均为活体重。根据上文技术方案，优选的情况下，步骤(1)中与生长性状相关的SLAF标签的筛选标准为：当显著性阈值超过临界值(LOD＝2-3)时，认为存在一个QTL位点。根据上文技术方案，优选的情况下，步骤(1)中用于设计KASP引物的SLAF标签的选取标准为：①SLAF标签中不存在插入缺失的SNP位点，②引物序列只能包含1个SNP位点，③根据碱基含量使退火温度控制在PCR要求的温度范围内，所述退火温度为55℃～65℃。根据上文技术方案，优选的情况下，步骤(2)中所述PCR扩增的温度为：55℃～65℃，PCR产物长度在200bp内。根据上文技术方案，优选的情况下，步骤(3)中获得与生长性状相关的KASP标记的标准为：将SNP位点的基因型分为2-3种，则标记视为可用。本专利技术的有益效果：在本专利技术中，用KASP标记对海胆生长性状进行标记，用KASP技术得到10个与生长性状(壳高、壳径、体重)相关的SNP位点，多位点标记筛选相对单一位点筛选准确性更高，在HRM技术中采用小片段引物法在用于G/C突变(Ⅲ类突变)或A/T突变(Ⅳ类突变)的基因分型时，由于Tm值相差太小，往往不容易将野生纯合子和突变纯合子分开。而且小片段引物法会因DNA模板的未均一化导致PCR产物量的差异进而造成熔解曲线混乱，严重影响基因分型的准确性。而KASP标记对DNA模板要求较低，只需模板在要求范围内便可进行准确分型。此外相KASP标记的检测费用与HRM相比较而言更低。本专利技术主要采用SLAF-seq技术和KASP技术，SLAF-seq技术是一套简化基因组测序技术，即通过设计适当的酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物，其特征在于，所述引物选自如下的KASP引物组：(1)SNP名称Marker49152，标记名称A007402，其对应的引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；(2)SNP名称Marker112898，标记名称A007399，其对应的引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；(3)SNP名称Marker140758，标记名称A007397，其对应的引物序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；(4)SNP名称Marker63934，标记名称A007389，其对应的引物序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；(5)SNP名称Marker203513，标记名称A007388，其对应的引物序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；(6)SNP名称Marker24433，标记名称A007376，其对应的引物序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；(7)SNP名称Marker72763，标记名称A007374，其对应的引物序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；(8)SNP名称Marker23360，标记名称A007366，其对应的引物序列如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；(9)SNP名称Marker13442，标记名称A007362，其对应的引物序列如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示；(10)SNP名称Marker6879，标记名称A007358，其对应的引物序列如SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。...
【技术特征摘要】
1.一种用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物，其特征在于，所述引物选自如下的KASP引物组：(1)SNP名称Marker49152，标记名称A007402，其对应的引物序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；(2)SNP名称Marker112898，标记名称A007399，其对应的引物序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；(3)SNP名称Marker140758，标记名称A007397，其对应的引物序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示；(4)SNP名称Marker63934，标记名称A007389，其对应的引物序列如SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；(5)SNP名称Marker203513，标记名称A007388，其对应的引物序列如SEQIDNO.13、SEQIDNO.14和SEQIDNO.15所示；(6)SNP名称Marker24433，标记名称A007376，其对应的引物序列如SEQIDNO.16、SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示；(7)SNP名称Marker72763，标记名称A007374，其对应的引物序列如SEQIDNO.19、SEQIDNO.20和SEQIDNO.21所示；(8)SNP名称Marker23360，标记名称A007366，其对应的引物序列如SEQIDNO.22、SEQIDNO.23和SEQIDNO.24所示；(9)SNP名称Marker13442，标记名称A007362，其对应的引物序列如SEQIDNO.25、SEQIDNO.26和SEQIDNO.27所示；(10)SNP名称Marker6879，标记名称A007358，其对应的引物序列如SEQIDNO.28、SEQIDNO.29和SEQIDNO.30所示。2.一种利用权利要求1所述的引物用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用中间球海胆已建...
【专利技术属性】
技术研发人员：常亚青，丁君，李磊，张伟杰，赵文飞，江会杰，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。