西伯利亚鲟及以西杂的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了西伯利亚鲟及西杂的鉴定方法，包括如下步骤：(1)以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，a、以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现215bp的扩增产物，则判断为西伯利亚鲟或西杂；或b、以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现252bp的扩增产物，则判断为施氏鲟或施杂；(2)对判断为西伯利亚鲟或西杂的鲟鱼DNA进一步鉴定：以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，以HLJSX48引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现163bp的扩增产物，则为西杂，否则为西伯利亚鲟；可以简单快速地可将西伯利亚鲟及以西伯利亚鲟为母本施氏鲟为父本杂交后代进行区分。

【技术实现步骤摘要】
西伯利亚鲟及以西杂的鉴定方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及西伯利亚鲟及西杂的鉴定方法。
技术介绍
施氏鲟和西伯利亚鲟是我国的2个重要养殖品种。自然条件下，施氏鲟仅分布于黑龙江(阿穆尔河)水系，是黑龙江的特有种和重要经济鱼类，其生长速度较快，但抗病力差、不耐运输，而且对活饵过于依赖较难驯化，在养殖过程中死亡率较高，加大了鲟鱼养殖业的风险。而西伯利亚鲟主要分布于中亚和东欧，在我国额尔齐斯河水系有少量分布，其生长速度慢，但抗病力强，耐运输。我国于2007年前后将西伯利亚鲟和施氏鲟的杂交组合繁育成功，因其正、反交的效果差别不大，所以统称为“西杂”。西杂较双亲有明显的生产优势，适应能力较强、生长速度较快、抗病力强、运输存活率高。西杂繁育成功之后，迅速在全国范围内推广养殖，现已成为东北、华北、华东、华中地区的主要养殖品种，是目前我国商品鲟鱼养殖规模与产量最大的品种。在西杂及其亲本的亲权鉴定方面已开展了部分研究，主要集中在同工酶生化标记研究上。吴艺等采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对施氏鲟、西伯利亚鲟及其正反杂交种4个群体5种组织(心、肝、肌、眼、肾)的酯酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)和乙醇脱氢酶(ADH)3种同工酶进行了分析，发现3种同工酶在各自群体内具有明显的组织特异性；在4个不同鲟鱼群体间也表现出明显的规律性差异,可作为区分这4种鲟鱼的生化遗传标记。尹洪滨等同样采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对4个群体5个组织进行9种同工酶表达分析发现杂交种的酶带表达比亲本复杂，但多与母本酶带表达相近，并通过聚类分析表明施氏鲟、施氏鲟(♀)×西伯利亚鲟(♂)杂交种聚为同一分支,西伯利亚鲟、西伯利亚鲟(♀)×施氏鲟(♂)杂交种聚为另一分支。采用此类方法进行鉴定，虽然操作简单，易于学习掌握，但是样品制备复杂，样本间产生的条带差异较小，极易受到样品采集方法和实验过程中的各种条件的影响，因此近年在鲟鱼鉴别中报道较少，多用于检测人工饲养条件下的鲟鱼个体健康评估与测定。为了能够更好的对西杂及其亲本西伯利亚鲟和施氏鲟进行鉴定，故急需开发一种快速、稳定、可靠的方法，为后续的研究提供可靠的基础。本专利技术中的西杂是指以西伯利亚鲟为母本施氏鲟为父本杂交后代；施杂是指以施氏鲟为母本西伯利亚鲟为父本杂交后代。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何快速、稳定、可靠地对西伯利亚鲟及西杂的进行鉴定。本专利技术的技术方案为：西伯利亚鲟及以西杂的鉴定方法，包括如下步骤：(1)以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，a、以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现215bp的扩增产物，则判断为西伯利亚鲟或西杂；或b、以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现252bp的扩增产物，则判断为施氏鲟或施杂；(2)对判断为西伯利亚鲟或西杂的鲟鱼DNA进一步鉴定：以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，以HLJSX48引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现163bp的扩增产物，则为西杂，否则为西伯利亚鲟；西伯利亚鲟引物对的前向引物序列为CAGATGCCAGTAACAGGCTGA(SEQIDNo.1所示)，后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT(SEQIDNo.2所示)；施氏鲟引物对的前向引物序列为TGTGGGGTCACGGACTTTACAG(SEQIDNo.3所示)，后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT(SEQIDNo.4所示)；HLJSX48引物对的前向引物序列为CTAAGCAAGCCTCTCGCTGT(SEQIDNo.5所示)，后向引物序列为GTTTTCCCAGTCACGACGTT(SEQIDNo.6所示)。进一步地，步骤(1)中，以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增的反应体系为DNA模板1μL、Mix12.5μL、ddH2O10.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5min；然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，50℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10min。进一步地，步骤(1)中，以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增的反应体系为DNA模板1μL、Mix12.5μL、ddH2O10.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5min；然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，53℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10min。进一步地，步骤(2)中，PCR扩增的反应体系为DNA模板1μL、Mix12.5μL、ddH2O10.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5min；然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，49℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10min。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：采用本专利技术的方法，可以简单快速地可将西伯利亚鲟及以西伯利亚鲟为母本施氏鲟为父本杂交后代进行区分。附图说明图1西伯利亚鲟引物对在西伯利亚鲟、施氏鲟及其杂交后代中扩增产物的琼脂糖电泳图谱；图2施氏鲟引物对在西伯利亚鲟、施氏鲟及其杂交后代中扩增产物的琼脂糖电泳图谱；图3HLJSX48引物对在西伯利亚鲟、施氏鲟及其杂交后代中扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。具体实施方式1.1.材料1.1实验材料：亲本样品：西伯利亚鲟34份，施氏鲟10份(取部分鳍条用无水乙醇保存)子代样品：西杂12尾，施杂12尾(取整体用无水乙醇保存)1.2实验器材：PCR仪：Bio-RadiCycler和MJ100；离心机：EppendorfCentrifuge5415D；稳压稳流电泳仪：Bio-RadpowerPAC300；凝胶成像系统：AlphalmageMultimageLightCabinet；电子天平、恒温水箱、培养箱、蒸汽灭菌器、摇床、离心机以及一些常用实验设备。1.3主要药品和试剂：双蒸水(MilliQ)、二水二胺四乙酸二钠(EDTA-Na.2H2O)、蛋白酶K(Merck公司)(10mg/mL)、Tris碱、浓盐酸、NaOH、MgCl2、Taq酶缓冲液、dNTPs(10mM)等等。2.方法2.1总基因组DNA的提取①切取不多于30mg的组织材料，放入装有200μlGA缓冲液的离心管中(离心管做好标记)，涡旋振荡15sec。②加入20μlProteinaseK(20mg/ml)溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠，在56℃放置(消化)，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。③加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。(注意：在等待时应放入4℃的冰箱中)④加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中，并做好标记)，12000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。⑥向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.西伯利亚鲟及以西杂的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，a、以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现215bp的扩增产物，则判断为西伯利亚鲟或西杂；或b、以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现252bp的扩增产物，则判断为施氏鲟或施杂；(2)对判断为西伯利亚鲟或西杂的鲟鱼DNA进一步鉴定：以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，以HLJSX48引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现163bp的扩增产物，则为西杂，否则为西伯利亚鲟；西伯利亚鲟引物对的前向引物序列为CAGATGCCAGTAACAGGCTGA，后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT；施氏鲟引物对的前向引物序列为TGTGGGGTCACGGACTTTACAG，后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT；HLJSX48引物对的前向引物序列为CTAAGCAAGCCTCTCGCTGT，后向引物序列为GTTTTCCCAGTCACGACGTT。

【技术特征摘要】
1.西伯利亚鲟及以西杂的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，a、以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现215bp的扩增产物，则判断为西伯利亚鲟或西杂；或b、以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现252bp的扩增产物，则判断为施氏鲟或施杂；(2)对判断为西伯利亚鲟或西杂的鲟鱼DNA进一步鉴定：以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，以HLJSX48引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现163bp的扩增产物，则为西杂，否则为西伯利亚鲟；西伯利亚鲟引物对的前向引物序列为CAGATGCCAGTAACAGGCTGA，后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT；施氏鲟引物对的前向引物序列为TGTGGGGTCACGGACTTTACAG，后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT；HLJSX48引物对的前向引物序列为CTAAGCAAGCCTCTCGCTGT，后向引物序列为GTTTTCCCAGTCACGACGTT。2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨世勇，赵仲孟，刘钊，黄小丽，苗懿，杜宗君，罗伟，陈虎，陈德芳，冯杨，段靖，熊关庆，任妍，李涛，张谨啸，张瀚艺，朱凌威，王云维，陈雨薇，杨磊，谭淦，刘洪李，卢永瑞，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51