一种非对称双特异性抗体制造技术

本发明专利技术涉及一种新型非对称双特异性抗体。本发明专利技术还涉及制备非对称双特异性抗体的方法以及使用这些抗体治疗疾病的方法。

An asymmetric bispecific antibody

The invention relates to a novel asymmetric bispecific antibody. The invention also relates to a method for preparing asymmetric bispecific antibodies and a method for treating diseases using these antibodies.

【技术实现步骤摘要】
一种非对称双特异性抗体
本专利技术涉及一种非对称双特异性抗体。
技术介绍
最近，开发了很多重组抗体类型，例如，通过融合例如IgG抗体类型和单链结构域得到的四价双特异性抗体。也开发了一些其它的新类型，其中不再保留抗体的核心结构(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)，例如能够结合两个或多个抗原的双抗体、三抗体或四抗体、微型抗体(minibody)和一些单链抗体(scFv，Bis-scFv)。双特异性抗体能够同时结合2种不同的靶标，迄今为止，已经描述了特异性针对某些细胞靶标的双特异性抗体。肿瘤是当前引起人类死亡的主要疾病之一。肿瘤的常规治疗手段是依靠手术、化疗和放疗，但大多数患者化疗后产生耐药、复发。手术结合化疗和放疗虽然能延长病人的生存时间，但许多肿瘤病人最后仍然发生肿瘤转移而死亡。单克隆抗体药物特异性高、毒副作用小、具有独特的生物学效应、在肿瘤靶向治疗领域具有越来越重要的地位。美国FDA已经批准上市了几十种治疗性抗体药物。在这些药物中，以Rituxan、Avastin、Herceptin等为代表的抗体药物，在治疗乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中表现出了好的疗效。目前公认的抗体抗肿瘤机制包括抑制关键信号传导、抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)、和补体依赖性细胞毒性(complementdependentcytotoxity，CDC)等。其中，抗体介导的细胞毒作用，即ADCC，是抗体杀死肿瘤细胞的主要机制之一。当抗体结合到肿瘤细胞表面的抗原以后，抗体的Fc段就与免疫效应细胞表面的Fc受体结合，继而引发效应细胞(例如NK细胞)对靶细胞的杀伤。许多单克隆抗体药物主要通过ADCC发挥抗肿瘤作用。普通IgG抗体的ADCC作用往往具有局限性，IgGFc招募效应细胞的能力有限，而且抑制性IgGFc受体的存在可以减弱对效应细胞的招募。双特异性抗体分子(Bispecificantibodies，BsAb)是增强ADCC的一个有效途径，已经在肿瘤免疫治疗中得到研究应用。例如美国FDA批准上市的Blinatumomab是一个抗CD19和抗CD3的单克隆抗体，其结构特点是将抗CD19单链抗体(scFv)和抗CD3scFv以连接序列直接相连接，成为所谓BiTE(bispecificTcellengager)技术平台。但Blinatumomab或者BiTE技术制备的双特异性抗体在体内的半衰期非常短，影响药物的效果。为了获得具有良好药学和药物动力学特性的双特异性抗体，研究者设计了许多不同的双特异性抗体，他们绝大多数都有种种缺陷，主要表现为：1)难以进行大规模生产，2)半衰期过短，3)双价结合免疫效应细胞，导致免疫效应细胞间互相杀伤。因此尽管双特异抗体是抗体药物研究的一个热点，但被批准进入临床应用的双特异抗体品种很少，期待在技术上进行创新。
技术实现思路
本专利技术人设计了一种全新结构的非对称双特异性抗体，其能够表现出更好的抗肿瘤效果，并且显著改善现有双特异性抗体的缺陷。特别地，本专利技术的一个目的在于构建能与免疫效应细胞通过单价结合的双特异抗体，它们一方面与肿瘤细胞的表面蛋白质结合，另一方面与免疫效应细胞单价结合，即一个双特异抗体分子只与一个免疫效应细胞结合，从而避免效应细胞之间的互相杀伤。同时，还必须保证该种双特异性抗体具有良好的体内半衰期。T细胞免疫应答反应是人体免疫系统中重要的环节，因此构建对T细胞和肿瘤细胞表面抗原的双特异的抗体可激活静止的T细胞对靶向肿瘤的杀伤，从而达到治疗恶性肿瘤的目的，可以用T细胞表面抗原CD3作为靶标。除此以外，其他免疫效应细胞的表面标志也可以作为双特异抗体的靶标。研究表明，IgA的受体FcαRI(CD89)表达在中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞和树突状细胞(DC)上，介导IgA和中性粒细胞、单核巨噬细胞等髓性细胞之间发的多种免疫效应过程。而中性粒细胞是数量最多的白细胞，成年人血液中中性粒细胞的数量约占白细胞总数的55％～70％。中性粒细胞可以更有效地介导肿瘤杀伤反应。因此我们也感兴趣于以CD89细胞为效应细胞的双特异抗体。肿瘤表面抗原CD19、CD20都是一种非糖基化的跨膜蛋白，具高度的保守性。CD19、CD20在大多数B淋巴细胞中表达，而在浆细胞，淋巴干细胞以及其它组织中均无表达，超过95％的B细胞淋巴瘤上都有CD19、CD20的表达且没有显著的内吞和脱落，这些特征使得CD19、CD20成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶抗原。通过构建双特异性抗体，可以靶向肿瘤细胞的同时募集表达CD3等标志的髓性效应细胞，从而达到更有效地杀死肿瘤细胞的目的。除了肿瘤免疫治疗，双特异抗体还可以用于其他疾病，例如通过靶向病毒抗原和CD3，可以引导T细胞杀死病毒，用于治疗病毒感染或病毒导致的疾病。根据靶标的性质，双特异抗体可以有不同的功能，从而达到治疗不同疾病的目的。尽管研究者已经设计了许多种双特异抗体，但它们仍然无法满足药物研发的需要。本专利技术的主要内容是设计了一种新型双特异性抗体，它们具有非对称的结构，因此称为非对称双特异抗体(Asymmetricbispecificantibody，AsBsAb)，它们在体内有较长的半衰期，可以较好地从细胞表达，更为重要的是，这种双特异抗体能与免疫效应细胞通过单价结合，即一个抗体分子只结合一个免疫效应细胞上的表位，可以防止免疫效应细胞间发生偶联而互相杀伤。本专利技术提供了一种分离的非对称双特异性抗体，其包含：第一链，其从N端至C端依次包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)；第二链，其从N端至C端依次包含重链可变区、重链恒定区和单链抗体(scFv)区，其中所述第一链的VL和CL与所述第二链重链VH和CH1共同组成针对第一抗原或表位的抗原结合片段(Fab)；所述第二链的重链恒定区包含抗体重链的CH1和Fc区；所述第二链的scFv区从N端至C端依次包含针对第二抗原的重链可变区和轻链可变区，或者从N端至C端依次包含针对第二抗原或表位的轻链可变区和重链可变区；和第三链，其包含第三链的重链Fc区，其中所述第三链的重链Fc区包含抗体铰链区、CH2和CH3。特别地，所述第二链包含位于CH1结构域和CH2结构域之间的铰链区，以及所述第三链从N端至C端依次包含第三链的铰链区和重链Fc区。特别地，所述第三链包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。特别地，所述第一链的轻链恒定区末端和所述第二链的重链恒定区末端之间具二硫桥相连。特别地，所述第二链的铰链区与所述第三链的铰链区具有二硫桥，如天然抗体中所存在的。特别地，所述第一链的轻链恒定区与所述第二链的重链恒定区之间具有二硫键连接，和/或其中第二链的CH3结构域和第三链的CH3结构域之间具有0、1或2个二硫桥，优选地其中通过在所述第二链的第二重链可变区和所述第二链的轻链可变区和/或所述第二链的CH3结构域和第三链的CH3结构域的相应位置处引入半胱氨酸来引入二硫桥。为了制备这样的双特异抗体，我们设计了一个三载体抗体表达系统。在这个系统中，双特异抗体有三条多肽链构成。第一条多肽链是抗体轻链，有完整的抗体可变区和恒定区序列；第二条多肽链是一条完整的抗体重链和另一个单链抗体(s本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的非对称双特异性抗体，其包含：第一链，其从N端至C端依次包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)；第二链，其从N端至C端依次包含重链可变区、重链恒定区和单链抗体(scFv)区，其中所述第一链的VL和CL与所述第二链重链VH和CH1共同组成针对第一抗原或表位的抗原结合片段(Fab)；所述第二链的重链恒定区包含抗体重链的CH1和Fc区；所述第二链的scFv区从N端至C端依次包含针对第二抗原的重链可变区和轻链可变区，或者从N端至C端依次包含针对第二抗原或表位的轻链可变区和重链可变区；和第三链，其包含第三链的重链Fc区，其中所述第三链的重链Fc区包含抗体铰链区、CH2和CH3。

【技术特征摘要】
1.一种分离的非对称双特异性抗体，其包含：第一链，其从N端至C端依次包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)；第二链，其从N端至C端依次包含重链可变区、重链恒定区和单链抗体(scFv)区，其中所述第一链的VL和CL与所述第二链重链VH和CH1共同组成针对第一抗原或表位的抗原结合片段(Fab)；所述第二链的重链恒定区包含抗体重链的CH1和Fc区；所述第二链的scFv区从N端至C端依次包含针对第二抗原的重链可变区和轻链可变区，或者从N端至C端依次包含针对第二抗原或表位的轻链可变区和重链可变区；和第三链，其包含第三链的重链Fc区，其中所述第三链的重链Fc区包含抗体铰链区、CH2和CH3。2.根据权利要求1的抗体，其中所述第二链包含位于CH1和Fc区之间的铰链区，以及所述第三链从N端至C端依次包含第三链的铰链区和重链Fc区，该第二链的铰链区和第三链的铰链区之间形成分子间二硫键。3.根据权利要求2的抗体，其中所述第一链的轻链恒定区与所述第二链的重链恒定区之间具有二硫键连接，和/或其中第二链的CH3结构域和第三链的CH3结构域之间具有0、1或2个二硫桥，优选地其中通过在所述第二链的第二重链可变区和所述第二链的轻链可变区和/或所述第二链的CH3结构域和第三链的CH3结构域的相应位置处引入半胱氨酸来引入二硫桥。4.根据权利要求1的抗体，其中对第二链的CH3结构域和第三链的CH3结构域相接触之界面进行修饰，以减少同源二聚体的形成，其中所述修饰为：a)将所述第二链的CH3结构域中位于上述界面内氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在所述界面的第二链一侧生成凸起，b)将所述第三链的CH3结构域中位于上述界面内氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在所述界面的第三链一侧生成凹洞，其中，所述凸起定位于所述凹洞中；或者a)将所述第二链的CH3结构域中位于上述界面内氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在所述界面的第二链一侧生成凹洞，b)将所述第三链的CH3结构域中位于上述界面内氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在所述界面的第三链一侧生成凸起，其中，所述凸起定位于所述凹洞中。5.根据权利要求4的抗体，其中所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自：精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，和色氨酸(W)优选地，将所述第二链的CH3结构域中位于上述界面内氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基为T366W突变；并且，其中所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自：丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，和缬氨酸(V)，优选地，将所述第二链的CH3结构域中位于上述界面内氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基为T366S、L368A和Y407V。6.根据权利要求1的抗体，其中对第二链的Fc区和/或第三链的重链Fc区进行进一步修饰，以去除ADCC效应功能，例如将297位Asn突变为Ala。7.根据权利要求1的抗体，其中所述第一链的轻链可变区与所述第二链的重链可变区能够特异性结合第一抗原或表位，和/或其中所述第二链的scFv区能够特异性结合第二抗原或表位，优选地其中所述第一抗原或表位不同于所述第二抗原或表位。8.根据权利要求1的抗体，其中所述第一抗原或表位是肿瘤细胞表面抗原或表位并且所述第二抗原或表位是免疫效应细胞表面抗原或表位，或者所述第一抗原或表位是免疫效应细胞表面抗原或表位并且所述第二抗原或表位是肿瘤细胞表面抗原或表位，或者所述第一抗原或表位是肿瘤细胞表面抗原或表位并且所述第二抗原或表位是另一种肿瘤细胞表面抗原或表位，优选地其中所述肿瘤细胞表面抗原或表位选自：AFP、BCMA、CA19-9、CA125、CEA、Claudin、DR5、EMP2、GPA33、EGFR、Folate、HER2、HER3、FGFR1、c-MET、PDGFR、VEGFR、CD16、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD47、CD123、CD133、CD137、CD138、PSMA、TAG72、Tim-3、Trop-2、P-cadherin、gp100、PD-L1、和EpCAM，以及所述免疫效应细胞表面抗原或表位可选自：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcαRI(CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：房健民，李冰宇，
申请(专利权)人：上海市同济医院，
类型：发明
国别省市：上海,31