本发明专利技术提供了用于结直肠癌相关基因甲基化的检测方法、试剂盒及应用。本发明专利技术涉及了用于检测LAD1基因甲基化的特异性引物对和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。本发明专利技术还提供了所述的特异性引物对和/或探针的应用、检测LAD1基因甲基化试剂盒和LAD1基因甲基化检测方法。本发明专利技术的检测方法具有高通量特性和高敏感性，且无需在PCR后进行电泳和分子杂交等操作，可减少实验过程中污染和操作误差，还能节约时间和节省试剂消耗，不仅能减少检测成本，提高检测效率，将为结直肠癌早期诊断和无创快速筛查提供有效手段，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
用于结直肠癌相关基因甲基化的检测方法、试剂盒及应用
本专利技术属于生物检测领域，特别涉及用于结直肠癌相关基因甲基化的检测方法、试剂盒及应用。
技术介绍
由于现有的结直肠癌筛查方法，如结肠镜检查、粪便sDNA检查、血清癌胚抗原(CEA)水平检查，存在效率低、准确性低或侵入性的特点，导致结直肠癌患者不能及时得到诊断，多数结直肠癌患者被发现时已经处于发展晚期，治疗和预后效果不佳。因此，寻找一种简单、安全、特异性高、灵敏性高的早期筛查方法是当前结直肠癌预防和治疗的关键。DNA甲基化(DNAmethylation)作为重要的表观遗传修饰之一，它与肿瘤的发生发展关系密切。狭义的DNA甲基化指由DNA甲基转移酶(DNAmethyhransferase，DNMT)介导，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将一个甲基基团共价结合到胞嘧啶(Cytoine，Cyt)环5位碳上，成为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)的化学修饰过程。DNA甲基化通常发生于CpG二核苷酸中，对基因的表达和调控有重要作用。目前，DNA甲基化已应用于肿瘤机制和诊治研究。结直肠癌的DNA甲基化研究中主要采用的是肿瘤组织，但是由于获取难度大，肿瘤组织样品并不适用于广泛筛查和早期诊断。研究者们尝试从非侵入性生物样品(如血液)中寻找生物标志物。此类样品具有适合大量样本收集、操作及处理简便等优点，其DNA甲基化有望成为非侵袭性肿瘤标志物来源，以更好地运用于临床。由于一些抑癌基因异常甲基化常发生在肿瘤形成的开始，可运用于早期检测。而混杂因素可能导致检测的假阳性，早期检测最关键的问题是区分非肿瘤如年龄、饮食等相关的甲基化与肿瘤特异甲基化，设计研究方案时应考虑各种混杂因素或选用独立个体。尽管目前已有一些抑癌基因如SPG20、FBN1、VIM等甲基化检测用于结直肠癌的早期诊断，但往往会出现特异性或灵敏性不强的特点。目前常用来进行检测基因甲基化的方法有甲基化特异性PCR(MS-PCR)、亚硫酸氢盐处理和测序等方法。MS-PCR方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，需要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。亚硫酸氢盐处理和测序一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。因此，甲基化检测特异性或灵敏性不强等技术问题还有待解决。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，为改善甲基化检测特异性或灵敏性不强等问题，提供用于检测LAD1基因甲基化的特异性引物对和探针。本专利技术的第二目的在于提供所述的特异性引物对和探针的应用。本专利技术的第三目的在于提供用于检测LAD1基因甲基化的试剂盒。本专利技术的第四目的在于提供基于所述的特异性引物对和/或探针的LAD1基因甲基化检测方法，利用本专利技术的特异性引物和/或探针来区分甲基化和未甲基化的DNA。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：用于检测LAD1基因甲基化的特异性引物对：LAD1-mF：GATTATCGGGTGTCGTAGTTC，(如SEQIDNO.1所示)LAD1-mR：CCCTAACGCAACGTACGCG。(如SEQIDNO.2所示)与所述的特异性引物对配合使用的荧光探针，包括以下任一序列：(1)TGAGTAGAATAAGGAGAGATTAT，(如SEQIDNO.3所示)(2)ACAACTAACACTTAACATTATAAC。(如SEQIDNO.4所示)所述的荧光探针在所述的序列的5’端标记荧光报告基团，在其3’端标记荧光淬灭基团。所述的特异性引物对和/或荧光探针在制备检测LAD1基因甲基化的试剂盒中的应用。一种用于检测LAD1基因甲基化的生物标志物，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。一种检测LAD1基因甲基化的试剂盒，包含所述的特异性引物对。所述的检测LAD1基因甲基化的试剂盒，还可以包括如下用于进一步确认非甲基化结果的引物对：LAD1-uF：AGATTATTGGGTGTTGTAGTTT，(如SEQIDNO.5所示)LAD1-uR：AACCCTAACACAACATACACA。(如SEQIDNO.6所示)所述的检测LAD1基因甲基化的试剂盒，还包含所述的荧光探针或DNA荧光染料。所述的检测LAD1基因甲基化的试剂盒，还可以包括阳性标准品、阴性质控品、PCR反应液、PCR酶中的至少一种。所述的阳性标准品为插入所述的用于检测LAD1基因甲基化的生物标志物的载体质粒。一种LAD1基因甲基化检测方法，利用如SEQIDNO.1～2所示的特异性引物和如SEQIDNO.5～6所示的荧光探针或荧光染料进行实时定量PCR，检测待测样本中的LAD1基因启动子区第26位和第27位甲基化程度(图1)。当采用荧光染料进行实时荧光PCR时，最佳反应条件为：预变性95℃，10min；95℃，15s，60℃，60s，40个循环；以每20s升温1℃速率从75℃升温至95℃，得到溶解曲线。当采用荧光探针进行实时荧光PCR时，最佳反应条件为：95℃，20min；50个PCR循环，每个循环中，先升温至62℃，5s，再降温至56℃，反应35s，最后升温至94℃，反应20s；50个循环反应后降温至40℃，反应30s。当所述的实时定量PCR为探针法时，与所述的特异性引物对配合使用的荧光探针优选为如SEQIDNO.3～4所示。所述的LAD1基因甲基化检测方法，还可以进一步利用如SEQIDNO.5～6所示的引物对进行实时定量PCR对LAD1基因非甲基化的结果进行进一步确认，以进一步提高结果准确性。如果只有甲基化引物发生扩增，说明第26和27位均发生了甲基化；如果甲基化的引物和非甲基化的引物都发生了扩增，说明该位点中只有第26或27位发生了甲基化；如果只有非甲基化引物发生扩增，则说明这两个位点是完全非甲基化。所述的待测样本优选为血液样本。所述的特异性引物对和/或探针、所述的检测LAD1基因甲基化的试剂盒或所述的LAD1基因甲基化检测方法在结直肠癌检测中的应用。本专利技术拟采用甲基化荧光法对待测样品DNA的中LAD1基因甲基化的检测。采用探针法和染色法对特定甲基化位点进行realtimePCR检测。信号强度与PCR产物的量成正比，据此可计算出样品的甲基化程度。LAD1为申请人新发现的结直肠癌抑癌基因，免疫组化结果提示它与结直肠癌的TNM分期及淋巴结转移负相关，理论研究提示该基因与结直肠癌细胞的失巢凋亡有关。然而目前就LAD1单独及其联合其他基因作为结直肠癌早期诊断本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测LAD1基因甲基化的特异性引物对，其特征在于：由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物为：GATTATCGGGTGTCGTAGTTC，所述的下游引物为：CCCTAACGCAACGTACGCG。
【技术特征摘要】
1.用于检测LAD1基因甲基化的特异性引物对，其特征在于：由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物为：GATTATCGGGTGTCGTAGTTC，所述的下游引物为：CCCTAACGCAACGTACGCG。2.与权利要求1所述的特异性引物对配合使用的荧光探针，其特征在于，包括以下任意序列：(1)TGAGTAGAATAAGGAGAGATTAT，(2)ACAACTAACACTTAACATTATAAC。3.权利要求1所述的特异性引物对和/或权利要求2所述的荧光探针在制备检测LAD1基因甲基化的试剂盒中的应用。4.一种用于检测LAD1基因甲基化的生物标志物，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。5.一种检测LAD1基因甲基化的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的特异性引物对。6.根据权利要求5所述的检测LAD1基因甲基化的试剂盒，其特征在于，还可以包括如下用于进一...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵杰，李艳红，单嘉杰，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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