一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的多面体探针及其制备方法和应用，包括核酸多面体骨架以及位于多面体顶角的识别靶基因的探针结构，所述探针结构上修饰淬灭基团，所述核酸多面体骨架上修饰发光基团；该探针可快速、灵敏、特异检测胞外囊泡内多种核酸分子，可根据临床或研究检测需要对特定的靶标核酸分子进行设计应用。

【技术实现步骤摘要】
一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用
本专利技术属于医疗检测领域，涉及一种用于原位无损检测胞外囊泡核酸小分子的多面体探针，可快速、灵敏、特异检测已知序列的多种胞外囊泡核酸小分子；本专利技术还涉及多面体探针的制备方法和应用。
技术介绍
胞外囊泡(EVs)是由肿瘤细胞等多种细胞分泌的、大小为50～1000nm的膜性囊泡小体，常存在于血液、尿液、脑脊液等大多数体液中。EVs可以携带多种胞内物质，如不同来源EVs可包含超过9700种蛋白质、3400种mRNA和2800种microRNA，在细胞间信号传递、肿瘤的发生与预后监测、免疫系统干预等生理病理活动中扮演了十分重要的角色。现有研究表明，受胞体体积的限制，特定来源的外泌体内miRNA浓度远高于其母体细胞内浓度，浓度富集效率甚至可高达166倍，导致少量miRNA可在外泌体内被检出而在循环系统中未能检出。同时，与循环系统中的游离miRNA相比，外泌体内的miRNA由于受囊泡脂质双层膜的保护因而具有更高的酶耐受性，可以在体液中长时间稳定存在，便于到达靶细胞进行稳定的信号转导从而发挥生物学效能。与循环miRNA相比，外泌体内miRNA水平变化更能反映机体内生理病理状态，因此可以作为一种新型的生物标志物，用以评进行疾病的早期诊断、治疗监控和预后评估。EVs的纳米级结构和miRNA极短的核苷酸序列长度(～22nt)使得EVs内miRNA多重检测极为困难。常规检测组织细胞中miRNA的方法以RT-qPCR为金标准，其灵敏度高，但其cDNA合成、qPCR等步骤耗时耗力且相对昂贵，不适合大规模EVs内miRNA筛查；尽管NorthernBlotting和微阵列检测技术各有其优点，但其灵敏度均欠佳且无法原位检测。原位杂交(FISH)尽管可以实现细胞内miRNA在体检测，然而其较低的灵敏度亦限制了其对于低浓度靶分子的检出。电化学传感器技术结合锁核酸(LNA)技术可有效提升检测特异性，然而其灵敏度和重复性仍有待提高，且上述技术均无法实现EVs的在体直接检测。目前大量的检测方法都集中在miRNA提取后进行检测，而不同提取方法的miRNA提取效率差异极大，即便用数字PCR也无法反映出EVs内miRNA的真实丰度。若能够实现EVs原位在体检测将能极大克服上述不一致问题，从而真实反映EVs内各种靶分子的丰度。为此，人们进行了如下探索：Rheeetal曾尝试着利用溶血素O蛋白(StreptolysinO)对EVs胞膜打孔，导入分子信标探针(MolecularBeacon，MB)并进行EVs在体检测，研究发现溶血素O蛋白处理后的探针穿透效率较无处理样本提高了175％。但在胞膜上打孔的方法会潜在破坏EVs外膜，存在EVs内容物外漏的风险，从而导致最终的检测结果偏低。上述方法均缺乏对胞外囊泡完整性的保护，存在EVs内容物外漏的风险，从而可能导致最终的检测结果偏低，仍不能准确检测EVsmiRNA。因此，亟需一种不破坏胞外囊泡完整性的检测方法，能够准确检测EVs内如miRNA等小分子。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的多面体探针；本专利技术的目的之二在于提供用于检测胞外囊泡miRNA的多面体探针的制备方法；本专利技术的目的之三在于提供所述多面体探针在制备检测胞外囊泡内核酸分子的试剂中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，包括核酸多面体骨架以及位于多面体顶角的识别靶基因的探针结构，所述探针结构上修饰淬灭基团，所述核酸多面体骨架上修饰发光基团。该探针具有穿膜性能优，检测灵敏度更高的探针，该探针是结合了DNA多面体和分子信标的特点，组成了一个通过多面体穿膜后利用分子信标的特点实现特异性检测核酸的探针。优选的，所述多面体为四面体、六面体或八面体；所述探针结构为茎环结构、三叶草结构、别针结构或者哑铃状结构。优选的，所述多面体骨架合成原料为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、肽核酸或锁核酸的一种或多种。优选的，所述发光基团可为Cy3、Cy5、Cy5.5、羧基荧光素、异硫氰酸荧光素、量子点或碳量子点的任意一种；所述淬灭基团可为BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、IOWA、Dabcyl中的任意一种，且其发光基团的发射光谱应该与淬灭基团的吸收光谱部分或者全部重叠。优选的，所述多面体骨架由多条相互互补的双链及未配对单碱基构成。优选的，待检胞外囊泡内的核酸分子在胞浆内游离存在，为游离cell-freeDNA、RNA、microRNA或环状RNA。优选的，所述探针结构与多面体骨架相对位置可旋转变化或者探针部分脱离多面体骨架。2、所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针的制备方法，将修饰淬灭基团或淬灭基团的核酸单链加入单链自组装的离子缓冲液中，然后变性后进行退火使其自组装，形成多面体探针。优选的，所述多面体为四面体时核酸单链的核苷酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.4所示，SEQIDNO.1的5'端修饰淬灭基团；所述SEQIDNO.2～SEQIDNO.4的5'端修饰有荧光基团；所述多面体为六面体时核酸单链的核苷酸序列如SEQIDNO.5～SEQIDNO.10所示，所述SEQIDNO.5～SEQIDNO.8的5'端修饰荧光基团，所述SEQIDNO.9和SEQIDNO.10的5'端修饰淬灭基团。3、所述多面体探针在制备原位检测胞外囊泡核酸分子的试剂中的应用。利用所述多面体探针检测胞外囊泡核酸分子的方法，包括如下步骤：将含有胞外囊泡的待测样品与该多面体探针共同孵育5-360分钟，然后在20-40℃环境下检测荧光强度。检测时经过充分温育后，多面体探针通过穿膜作用进入样本中的胞外囊泡，在未与胞外囊泡内miRNA结合时多面体探针不会或只会有微弱的荧光被检测到，当多面体探针和胞外囊泡内miRNA结合时，多面体探针的茎环部分打开，茎环序列部分可完全或者部分与miRNA靶标序列互补，淬灭基团原理荧光基团，多面体探针会被检测到增强的荧光，从而实现特异性检测。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开的多面体探针，使用核酸骨架的多面体，茎环探针，荧光基团，淬灭基团等，结构明确，易获得；制备方法简单，通过简单的加热和降温过程即可完成自组装；可以用于胞外囊泡核酸分子，特别是miRNA检测，且检测方法简单只需将样品与该多面体探针在反应孔中共同温育后，采用常规的荧光光谱仪即可得出结果，操作使用方便；还具有如下优点：(1)检测所需血量少，节约样本量，检测流程简单，检测时间缩短，有利于提高检测及筛查效率；(2)探针的茎环状部分序列可根据待测核酸分子(如：miRNA)序列进行设计改变，从而可用于所有已知核酸序列(如：miRNA)的特异性检测，该探针可以作为核酸分子(如：miRNA)检测模板应用于各类检测当中；(3)通过采取不同荧光探针和淬灭基团修饰及不同序列设计的茎环结构探针条可用于多种胞外囊泡核酸分子(如：miRNA)多重检测，这样可以同时针对同一样品中特定的核酸分子(如：miRNA)组合进行分析，通过不同激发波长分别检测不同核酸分子(如：miRNA)的荧光强度值，简化操作流程，实现一次加样，多个核酸分子(如：miRNA)同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：包括核酸多面体骨架以及位于多面体顶角的识别靶基因的探针结构，所述探针结构上修饰淬灭基团，所述核酸多面体骨架上修饰发光基团。

【技术特征摘要】
1.一种用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：包括核酸多面体骨架以及位于多面体顶角的识别靶基因的探针结构，所述探针结构上修饰淬灭基团，所述核酸多面体骨架上修饰发光基团。2.根据权利要求1所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：所述多面体为四面体、六面体或八面体；所述探针结构为茎环结构、三叶草结构、别针结构或者哑铃状结构。3.根据权利要求1所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：所述多面体骨架合成原料为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、肽核酸或锁核酸的一种或多种。4.根据权利要求1所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：所述发光基团为Cy3、Cy5、Cy5.5、羧基荧光素、异硫氰酸荧光素、量子点或碳量子点的任意一种；所述淬灭基团可为BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、IOWA、Dabcyl中的任意一种，且其发光基团的发射光谱应该与淬灭基团的吸收光谱部分或者全部重叠。5.根据权利要求1所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在于：所述多面体骨架由多条相互互补的双链及未配对单碱基构成。6.根据权利要求1所述用于原位无损检测胞外囊泡核酸分子的多面体探针，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗阳，刘炼华，贾玫，陈晓辉，张洪，邱晓沛，卿光超，刘春姣，王睿璇，周旋，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50