一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法，其原理是草酰乙酸与衍生剂反应后，产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离，紫外检测器测定其含量。本发明专利技术的方法需用到的高效液相色谱仪精密度高，可以检测到微克级别的含量，检测灵敏度高。本发明专利技术的方法样本前处理过程简单易操作。本发明专利技术的提取液成分简单，只需水溶液提取，成本低。本发明专利技术的方法的测定步骤都是仪器自动化操作，可以连续检测上百样品，读取准确数据，每一个样品测试时间短。本发明专利技术的相对于生物免疫检测方法，价格优势明显，所需试剂基本无毒。

A method for determination of content of acetoacetic acid based on high performance liquid chromatography

The invention discloses a method for determining the content of oxaloacetic acid based on high performance liquid chromatography. The principle is that oxaloacetic acid reacts with derivatives to produce absorbed substances under ultraviolet light, which are separated by high performance liquid chromatography and determined by ultraviolet detector. The method of the invention needs a high precision high performance liquid chromatograph, which can detect the content of microgram level and has high detection sensitivity. The sample pretreatment process of the method is simple and easy to operate. The extraction liquid of the invention is simple in composition and needs only water extraction, and the cost is low. The measuring steps of the method of the invention are automatic operation of the instrument, which can continuously detect hundreds of samples, read accurate data, and each sample has a short testing time. Compared with the biological immune detection method, the invention has obvious price advantages, and the required reagents are basically non-toxic.

【技术实现步骤摘要】
一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法
本专利技术属于生命科学领域领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法（HPLC）的草酰乙酸含量测定方法。
技术介绍
草酰乙酸是三羧酸循环的一个中间产物，是在苹果酸脱氢酶的催化下由苹果酸生成的，它与乙酰辅酶A缩合生成柠檬酸，开始新的循环。草酰乙酸可在丙酮酸羧化酶的作用下，由丙酮酸与CO2生成；也可在转氨酶的作用下，由天冬氨酸生成。另外，草酰乙酸已知也可作为琥珀酸脱氢酶的抑制剂。目前市面上已有的检测草酰乙酸的方法可分为两大类，包括生物免疫检测技术以及高效液相检测技术。生物免疫检测的方法一来容易受到交叉反应的干扰，二来抗体的不通用性以及制备时间较长，整个时间周期很长，价格昂贵。色谱技术近些年飞速发展，检测生物体内小分子越来越广泛。但是现在市面上基于高效液相色谱检测草酰乙酸的检测技术，鲜有报道，同时对于样品的前处理普遍繁琐，且损失率较高。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术旨在提供一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法，不仅前处理过程简单易操作，而且可准确检测草酰乙酸的含量。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法，其原理是草酰乙酸与衍生剂反应后，产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离，紫外检测器测定其含量；该方法的具体包括以下步骤：步骤1仪器和用品的准备；准备高效液相色谱仪（耐水C18柱，紫外检测器）、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、甲醇（色谱级）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；步骤2试剂的配制；1）试剂一：76mL超纯水中加入4mL盐酸，混匀后加入5mgEDTA，混匀；2）试剂二：10mL超纯水中加入80mgNaOH，混匀；3）试剂三：10mL超纯水中加入80mg盐酸苯肼，混匀；4）试剂四：10mL超纯水中加入141.4mg磷酸氢二钾，51.8mg磷酸二氢钾，混匀；5）试剂五：0.5mg草酰乙酸标准品置于1.5mLEP管中，2-8℃保存；步骤3实验前的准备工作；1）将超纯水800mL和甲醇500mL采用0.45μm水系滤膜和0.45μm有机系滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱；2）流动相的配制：称量1.415g磷酸二氢钾和182.6mg磷酸氢二钾溶于800mL超纯水中，配置成流动相A；流动相B为纯甲醇；由体积比为95%的所述流动相A和5%的所述流动相B配置成流动相；3）将配好的所述流动相超声30分钟，以脱去所述流动相中的气泡，防止堵塞色谱柱；步骤4草酰乙酸的提取；称取0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入一支EP管内，在4℃下浸提60min，采用离心率10000g，4℃下离心10min，提取上清液；步骤5草酰乙酸的衍生反应；取250μL的上述上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试剂四，确保体系pH在6.8~7.4之间，在25℃下反应30min，取样上高效液相色谱仪测定；步骤6标准品的配制；在试剂五中加入1mL超纯水，配成500μg/mL的母液，将所述母液用超纯水分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL的草酰乙酸标准品溶液；不同浓度的所述草酰乙酸标准品溶液均按照上述衍生条件反应，反应结束后取适量上高效液相色谱仪检测；步骤7仪器的调试和预设；1）开启电脑、泵和紫外检测器，安装上耐水C18柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，流速1.0mL/min，柱温25℃，波长325nm，走样时间为50min，设置完毕保存方法组；2）用所述流动相过耐水C18柱的柱子，待基线稳定后开始加样；步骤8样本的测定；1）在耐水C18柱中分别加入不同浓度的所述草酰乙酸标准品溶液10μL，利用紫外检测器记录不同浓度的所述草酰乙酸标准品的峰面积，用于计算标准曲线；2）在上述耐水C18柱中加入样品10μL，所述草酰乙酸标准品溶液可在50min内分离草酰乙酸衍生物，草酰乙酸衍生物的保留时间在42min左右，利用紫外检测器在草酰乙酸衍生物的相应保留时间处检测草酰乙酸衍生物的峰面积；步骤9草酰乙酸含量的计算；以所述草酰乙酸标准品溶液浓度（μg/mL）为横坐标，所述草酰乙酸标准品溶液的峰面积为纵坐标计算草酰乙酸标准曲线；将样品峰面积代入所述所述草酰乙酸标准曲线，计算样品中草酰乙酸含量。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术的方法需用到的高效液相色谱仪精密度高，可以检测到微克级别的含量，检测灵敏度高。2、本专利技术的方法样本前处理过程简单易操作。3、本专利技术的提取液成分简单，只需水溶液提取，成本低。4、本专利技术的方法的测定步骤都是仪器自动化操作，可以连续检测上百样品，读取准确数据，每一个样品测试时间短。5、本专利技术的相对于生物免疫检测方法，价格优势明显，所需试剂基本无毒。6.流动相主要成分为纯水，绿色环保，成本低。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例详细说明。本专利技术的具体实施方式由以下实施例详细给出。具体实施方式下面将结合实施例，来详细说明本专利技术。一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法，其原理是草酰乙酸与衍生剂反应后，产生紫外下有吸收的物质，利用高效液相色谱法分离，紫外检测器测定其含量；该方法的具体包括以下步骤：步骤1仪器和用品的准备；准备高效液相色谱仪（耐水C18柱，紫外检测器）、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、甲醇（色谱级）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；步骤2试剂的配制；1）试剂一：76mL超纯水中加入4mL盐酸，混匀后加入5mgEDTA，混匀；2）试剂二：10mL超纯水中加入80mgNaOH，混匀；3）试剂三：10mL超纯水中加入80mg盐酸苯肼，混匀；4）试剂四：10mL超纯水中加入141.4mg磷酸氢二钾，51.8mg磷酸二氢钾，混匀；5）试剂五：0.5mg草酰乙酸标准品置于1.5mLEP管中，2-8℃保存；步骤3实验前的准备工作；1）将超纯水800mL和甲醇500mL采用0.45μm水系滤膜和0.45μm有机系滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱；2）流动相的配制：称量1.415g磷酸二氢钾和182.6mg磷酸氢二钾溶于800mL超纯水中，配置成流动相A；流动相B为纯甲醇；由体积比为95%的所述流动相A和5%的所述流动相B配置成流动相；3）将配好的所述流动相超声30分钟，以脱去所述流动相中的气泡，防止堵塞色谱柱；步骤4草酰乙酸的提取；称取0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入一支EP管内，在4℃下浸提60min，采用离心率10000g，4℃下离心10min，提取上清液；步骤5草酰乙酸的衍生反应；取250μL的上述上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1仪器和用品的准备；准备高效液相色谱仪、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；所述高效液相色谱仪包括耐水C18柱和紫外检测器；步骤2试剂的配制；1）试剂一：在超纯水中加入盐酸，混匀后加入 EDTA，混匀；2）试剂二：在超纯水中加入 NaOH，混匀；3）试剂三：在超纯水中加入盐酸苯肼，混匀；4）试剂四：在超纯水中加入磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，混匀；5）试剂五：0.5mg草酰乙酸标准品置于1.5 mL EP管中，2‑8℃保存；步骤3实验前的准备工作；1）将超纯水800 mL和甲醇500 mL采用0.45μm水系滤膜和0.45μm有机系滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱；2）流动相的配制：将磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶于超纯水中，配置成流动相A；流动相B为纯甲醇；由体积比为95%的所述流动相A和5%的所述流动相B配置成流动相；3）将配好的所述流动相超声30分钟，以脱去所述流动相中的气泡，防止堵塞色谱柱；步骤4草酰乙酸的提取；称取0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入一支EP管内，在4℃下浸提60min，采用离心率10000g，4℃下离心10min，提取上清液；步骤5草酰乙酸的衍生反应；取250μL的上述上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试剂四，确保体系pH在6.8~7.4之间，在25℃下反应30min，取样上高效液相色谱仪测定；步骤6标准品的配制；在试剂五中加入1mL超纯水，配成500μg /mL的母液，将所述母液用超纯水分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL的草酰乙酸标准品溶液；不同浓度的所述草酰乙酸标准品溶液均按照上述衍生条件反应，反应结束后取适量上高效液相色谱仪检测；步骤7 仪器的调试和预设；1）开启电脑、泵和紫外检测器，安装上耐水C18柱，打开软件，在方法组中设置进样量，流速，柱温，波长以及走样时间，设置完毕保存方法组；2）用所述流动相过耐水C18柱的柱子，待基线稳定后开始加样；步骤8样本的测定；1）在耐水C18柱中分别加入不同浓度的所述草酰乙酸标准品溶液10μL，利用紫外检测器记录不同浓度的所述草酰乙酸标准品的峰面积，用于计算标准曲线；2）在上述耐水C18柱中加入样品10μL，利用紫外检测器在草酰乙酸衍生物的相应保留时间处检测草酰乙酸衍生物的峰面积；步骤9 草酰乙酸含量的计算；以所述草酰乙酸标准品溶液浓度为横坐标，所述草酰乙酸标准品溶液的峰面积为纵坐标计算草酰乙酸标准曲线；将样品峰面积代入所述所述草酰乙酸标准曲线，计算样品中草酰乙酸含量。...

【技术特征摘要】
1.一种基于高效液相色谱法的草酰乙酸含量测定方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1仪器和用品的准备；准备高效液相色谱仪、低速离心机、超声波清洗器、溶剂抽滤装置、0.45μm水系滤膜、0.45μm有机系滤膜、50个0.22μm水系针头式过滤器、可调式移液器、50个2mL样品瓶、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和超纯水；所述高效液相色谱仪包括耐水C18柱和紫外检测器；步骤2试剂的配制；1）试剂一：在超纯水中加入盐酸，混匀后加入EDTA，混匀；2）试剂二：在超纯水中加入NaOH，混匀；3）试剂三：在超纯水中加入盐酸苯肼，混匀；4）试剂四：在超纯水中加入磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，混匀；5）试剂五：0.5mg草酰乙酸标准品置于1.5mLEP管中，2-8℃保存；步骤3实验前的准备工作；1）将超纯水800mL和甲醇500mL采用0.45μm水系滤膜和0.45μm有机系滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱；2）流动相的配制：将磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶于超纯水中，配置成流动相A；流动相B为纯甲醇；由体积比为95%的所述流动相A和5%的所述流动相B配置成流动相；3）将配好的所述流动相超声30分钟，以脱去所述流动相中的气泡，防止堵塞色谱柱；步骤4草酰乙酸的提取；称取0.2g样本，放入研钵中磨碎，加入0.2mL预冷的试剂一，以及0.5mL预冷的超纯水，移入一支EP管内，在4℃下浸提60min，采用离心率10000g，4℃下离心10min，提取上清液；步骤5草酰乙酸的衍生反应；取250μL的上述上清液，向其中加入50μL的试剂二，200μL试剂三，175μL试剂四，确保体系pH在6.8~7.4之间，在25℃下反应30min，取样上高效液相色谱仪测定；步骤6标准品的配制；在试剂五中加入1mL超纯水，配成500μg/mL的母液，将所述母液用超纯水分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL的草酰乙酸标准品溶液；不同浓度的所述草酰乙酸标准品溶液均按照上述衍生条件反应，反应结束后取适量上高效液相色谱仪检测；步骤7仪器的调试和预设；1）开启电脑、泵和紫外检测器，安装上耐水C18柱，打开软件，在方法组中设置进样量，流速，柱温，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王黔，赵林川，
申请(专利权)人：苏州科铭生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32