一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器及其应用，涉及分析化学领域。该迷你蛋白反应器主要由固定化金属螯合层析IMAC磁珠和C18beads组成。预计将从不到10μL血清作为样本进行蛋白质组概况分析，并可能用于转化研究。此方法采用串联柱分离技术实现了蛋白质组学中复杂的样品制备步骤，包括磷酸化蛋白质预浓缩，还原，烷基化和消化，以及脱盐和分馏。本发明专利技术的方法易于使用、耗时短(

A mini protein reactor for preparation of proteome samples and its application

The invention discloses a mini protein reactor applied to the preparation of proteomic samples and its application, which relates to the field of analytical chemistry. The mini protein reactor is mainly composed of immobilized metal chelating chromatography IMAC magnetic beads and C18beads. Proteome profiling from less than 10 mu L of serum is expected and may be used for transformation studies. The complex sample preparation steps in proteomics, including preconcentration, reduction, alkylation and digestion of phosphorylated proteins, desalination and fractionation, were realized by tandem column separation. The method of the invention is easy to use and time-consuming.

【技术实现步骤摘要】
一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器及其应用
本专利技术涉及分析化学领域，特别涉及一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器及其应用。
技术介绍
可逆的蛋白磷酸化和去磷酸化过程调控着生物体的很多生命活动，控制着生命体的很多生理和病理过程，例如细胞的增殖、生长、分化和凋亡以及细胞信号的转导，细胞的凋亡等，被形象的称为生命活动的开关；另一方面，磷酸化过程的异常都会导致一系列常见疾病，其中包括肿瘤癌症，心脏疾病和老年痴呆症等(1)，磷酸化激酶抑制剂在降低抗肿瘤方面的治疗已被广泛认可(2)。例如：VEGF信号转导的主要受体包括fms样酪氨酸激酶VEGFR-1和胎儿肝激酶插入区受体VEGFR-2。其中，VEGFR-2主要分布在肿瘤血管内皮细胞等；它的主要作用是介导VEGF的血管内皮细胞增生，趋化内皮细胞和增加血管通透性等功能，因此为肿瘤化疗给药提供血供，增加药物递送功能(3)。因此，磷酸化是影响蛋白功能的最主要的翻译后修饰之一(4)，其与肿瘤的发生发展互为因果(5)。近年来进一步研究发现，肿瘤中特异性表达的磷酸化蛋白质已成为肿瘤诊断、预防和治疗的潜在新靶点。因此更深层的研究肿瘤蛋白质特征及其形成机制在肿瘤诊断和治疗上均具有重要生物医学意义。已有的细胞生物学蛋白分析方法无法提供详细的蛋白生化反应途径的变化(6)。而目前正在发展的蛋白组学研究手段，可以在一定程度上为肿瘤新靶点的找寻提供高通量数据信息(7)。尽管基于高分辨率质谱(MS)的蛋白质组学的技术已经趋于成熟，但蛋白质组学技术中样品制备这个关键环节中，还有诸多问题亟待解决，如低丰度蛋白难以检测、修饰的蛋白容易降解等。而这些问题均与制备过程中样品消耗大、耗时长、处理复杂及低特异性相关。通常，标准蛋白质组学需要大量血清标本(>500μL血清)。然而，大多数情况下我们获得的标本量较少，从而限制了其功能研究(8)。因此，研究者们致力于开发高灵敏度、多数量(例如每个样本>5000个蛋白质)，同时消耗少量生物样品的制备技术。但是，已经发表的方法不能用于痕量磷酸化蛋白的富集(9)，因此，选择一种材料来特异性富集磷酸化蛋白是非常必要的。胰腺导管腺癌(PDAC)是最常见的胰腺恶性肿瘤，95％患者在确诊10个月内死亡。但是，对于PDAC标志性蛋白，目前应用的检测方法由于含量低在PDAC早期无法被检测，只有在晚期才能被发现，这也是导致胰腺癌治疗失败的主要原因(10，11)。因此，开发一种方法提高对PDAC发生相关的磷酸化标志性蛋白检测灵敏度，以期到达早诊断、早治疗，并最终提高生存率是我们的终极目标。参考文献：(1)RaggiaschiR,GottaS,TerstappenGC.PhosphoproteomeAnalysis.BioscienceReports.2005；25(1-2):33-44.(2)CasadoP,WilkesEH,Miraki-MoudF,HadiMM,Rio-MachinA,RajeeveV,etal.Proteomicandgenomicintegrationidentifieskinaseanddifferentiationdeterminantsofkinaseinhibitorsensitivityinleukemiacells.Leukemia.2017.(3)WitteL,HicklinDJ,ZhuZ,PytowskiB,KotanidesH,RockwellP,etal.MonoclonalantibodiestargetingtheVEGFreceptor-2(Flk1/KDR)asananti-angiogenictherapeuticstrategy.Cancer&MetastasisReviews.1998；17(2):155.(4)RahimiN,CostelloCE.Emergingrolesofpost-translationalmodificationsinsignaltransductionandangiogenesis.Proteomics.2015；15(2-3):300-9.(5)MonettiM,NagarajN,SharmaK,etal.Large-scalephosphositequantificationintissuesbyaspike-inSILACmethod.NatureMethods,2011,8(8):655.(6)MeissnerF,MannM.Directproteomicquantificationofthesecretomeofactivatedimmunecells.Science,2013,340(6131):475-478.(7)MertinsP,QiaoJW,PatelJ,etal.Integratedproteomicanalysisofpost-translationalmodificationsbyserialenrichment.NatureMethods,2013,10(7):634.(8)RichardsAL,HebertAS,UlbrichA,etal.One-hourproteomeanalysisinyeast.NatureProtocols,2015,10(5):701-14.(9)WendongChen,ShuaiWang,SubashAdhikari,etal.SimpleandIntegratedSpintip-basedTechnologyAppliedforDeepProteomeProfiling,Anal.Chem.,2016,88,4864-4871(10)WongPP,DemirciogluF,GhazalyE,etal.Dual-actioncombinationtherapyenhancesangiogenesiswhilereducingtumorgrowthandspread.CancerCell.2015；27(1):123-37.(11)WongPP,BodrugN,Hodivala-DilkeKM.ExploringNovelMethodsforModulatingTumorBloodVesselsinCancerTreatment.CurrBiol.2016；26(21):R1161-R6。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器。该迷你蛋白反应器主要由固定化金属螯合层析IMAC磁珠和C18beads(C18小柱)组成。此种方法采用串联柱分离技术实现了蛋白质组学中复杂的样品制备步骤，包括磷酸化蛋白质预浓缩，还原，烷基化和消化，以及脱盐和分馏。影响IMAC磷酸化蛋白纯化效果有很多，但其中洗脱条件是主要因素，包括洗脱液pH、组成及离子强度。其中pH通过质子改变金属配体的负电性及氨基酸残基上的质子化程度而进行洗脱效果的调节。洗脱液的组成可改变的范围较广，多种途径共同调节着纯化效果。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器，包括移液器吸头、C18beads、IMAC磁珠、适配器、Eppend本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器，其特征在于：包括移液器吸头、C18beads、IMAC磁珠、适配器、Eppendorf管；移液器吸头内从下而上依次设置有若干C18beads、若干IMAC磁珠；C18beads与IMAC磁珠相互接触；适配器套在移液器吸头上，适配器放在Eppendorf管上端；移液器吸头的尖端插入至Eppendorf管内。

【技术特征摘要】
1.一种应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器，其特征在于：包括移液器吸头、C18beads、IMAC磁珠、适配器、Eppendorf管；移液器吸头内从下而上依次设置有若干C18beads、若干IMAC磁珠；C18beads与IMAC磁珠相互接触；适配器套在移液器吸头上，适配器放在Eppendorf管上端；移液器吸头的尖端插入至Eppendorf管内。2.根据权利要求1所述的应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器，其特征在于：所述的移液器吸头为10～200μL移液器吸头；所述的Eppendorf管为500μL～2.0mLEppendorf管。3.根据权利要求1所述的应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器，其特征在于：所述的C18beads为2～5μmEmporeC18beads；所述的IMAC磁珠为10～50μmIMAC磁珠。4.根据权利要求1或3所述的应用于蛋白质组样品制备的迷你蛋白反应器，其特征在于：所述的C18beads为3μmEmporeC18beads；所述的IMAC磁珠为20μmIMAC磁珠。5.一种利用权利要求1～4任一项所述的迷你蛋白反应器制备蛋白质组学样品的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)血清样本的采集：收集待测血清后，置于-80℃保存；(2)富集：上样之前，从下而上依次设置有若干C18beads、若干IMAC磁珠的移液器吸头分别用甲醇和pH7.2的10mM磷酸盐缓冲液平衡；将待测血清通过70％甲醇沉淀蛋白，然后用pH7.2的10mM磷酸盐缓冲液复溶蛋白，作为样品溶液，进行上样；(3)还原：用含20％乙腈的pH6～8的5～20mM磷酸盐缓冲液洗涤后，注入尖端含10mM的组氨酸或甘氨酸的pH6～8的5～20mM磷酸盐缓冲液，并在室温下孵育15分钟，加二硫苏糖醇还原蛋白质；(4)烷基化及消化：用2mM胰蛋白酶加100mM碘乙酰胺烷基化，pH8的100～200mM碳酸氢铵中灌注并在室温避光孵育60分钟，离心除去溶液；(5)将肽从IMAC磁珠转移至具有pH8的150～200mMTrisHCl的C18beads中；用pH8的200mMTris-HCl离心洗涤脱盐后，用20μL梯度递增的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄炳培，孟琼，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：广东,44