采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵，特别是指一种采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法。方法包括种子液的制备、在通气发酵过程中通过流加营养组分培养的方式制备岩藻黄素发酵液等工艺步骤；本发明专利技术解决了现有技术存在的异养培养制备的平滑菱形藻发酵液中发酵细胞密度和岩藻黄素产率低的技术难题。具有所制备的平滑菱形藻发酵液中细胞密度及岩藻黄素产率高、可以稳定实现连续工业化生产、能够从培养基的源头控制重金属、多氯联苯等海洋常见污染物、较大型海藻来源的岩藻黄素更安全等优点。

Preparation of fucoidin fermentation broth by fed batch culture

The invention belongs to microbial fermentation, in particular to a method for preparing fucoxanthin fermentation broth by fed-aeration culture. The method includes the preparation of seed liquid, the preparation of fucoxanthin fermentation liquid by feeding nutrient components during aeration fermentation, etc. The invention solves the technical problem of low fermentation cell density and fucoxanthin yield in the smooth rhombohydrophyte fermentation liquid prepared by heterotrophic culture. It has the advantages of high cell density and fucoxanthin yield in the fermentation broth of smooth rhombohedral algae, stable and industrialized production, control of heavy metals, PCBs and other common marine pollutants from the source of culture medium, and higher safety than fucoxanthin from macroalgae.

【技术实现步骤摘要】
采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法
本专利技术属于微生物发酵，特别是指一种采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法。
技术介绍
岩藻黄素(Fucoxanthin)，又称岩藻黄质、褐藻素，是一种天然的类胡萝卜素，参与光合作用中光系统II的反应，主要来自大藻、硅藻及金藻等大型海藻和微藻。近年来研究发现，岩藻黄素具有多种功能活性，包括抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病和抗疟等生理活性，具有广阔保健食品和药物开发前景。目前市场上岩藻黄素主要是从裙带菜、海带等大型海藻中提取获得，但是大型海藻细胞壁厚、多糖类物质含量高、纯化困难，存在海洋污染等问题，且大型海藻中岩藻黄素含量极低(仅为干重的0.01％-0.07％)。综上所述，岩藻黄素的产品质量在一定程度上难以保证，并且下游分离纯化的难度加大，因其对提取分离纯化有更高的技术要求，从而导致高纯岩藻黄素价格昂贵，进一步限制了岩藻黄素的应用。一些海洋微藻细胞中岩藻黄素含量即高达0.6％，是大型海藻的近100倍，海洋微藻是岩藻黄素更好的替代来源。硅藻为分布广泛的海洋微藻，在海洋、淡水及潮湿的表面上均广泛存在，一般依靠光能合成自身所需的养分。研究发现舟形藻属、小环藻属、筒柱藻属等硅藻可异养培养生长，本申请中的设计人发现其生物量浓度极低，较难应用于高密度异养发酵(Guo,etal.,2016)。平滑菱形藻(Nitzchialaevis)是一种单细胞藻类，属于硅藻门(Bacillariophyta)，羽纹硅藻纲(Pennaeae)，双菱藻目(Surirellales)，菱形藻属(Nitzschia)，具有异养发酵培养的潜力。利用平滑菱形藻生产岩藻黄素的研究较少。申请人经检索发现申请号为201310329269.X的专利文献中公开了一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，提出平滑菱形藻可用于光照培养生产岩藻黄素，但是该文献仅公开了利用小环藻制备岩藻黄素的方法、步骤及工艺条件，且并未公布采用其他菌种可进行岩藻黄素的生产，同时其中也未见相关的培养条件、光照强度、培养基组份、生物量浓度等培养结果以及岩藻黄素含量和产率等一系列关键技术信息。申请人于申请号为201710523735.6的专利文献中公开了一种利用平滑菱形藻异养发酵生产岩藻黄素的方法，上述专利文献优化了适合平滑菱形藻生长和岩藻黄素积累的碳源浓度、氮源种类和浓度、硅酸盐浓度等条件，获得了较高的岩藻黄素产率，阐述了初始葡萄糖浓度为10g/L时细胞比生长速率和岩藻黄素产率最高，而初始硝酸钠浓度为1g/L时细胞比生长速率和岩藻黄素产率最高，分批发酵条件下最高细胞浓度仅为4.5g/L，而此时岩藻黄素的含量和产率均为最低。上述文献中未涉及流加发酵及相关内容提高岩藻黄素产率，而结果分析说明初始发酵培养基在10g/L以上葡萄糖浓度和1g/L以上硝酸盐浓度下均有显著抑制作用。本申请的设计人等利用异养手段培养平滑菱形藻，细胞密度仅为1.5-4.5g/L，岩藻黄素产率仅为3.31mg/(L·d)。因此有必要通过对于发酵工艺的进一步优化，以提高发酵细胞密度和岩藻黄素产率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法。通过在通气培养平滑菱形藻藻种的过程中通过流加营养组分，优化发酵条件，进而进一步提高发酵生产岩藻黄素的产率。本专利技术的整体技术构思是：采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：A、种子液的制备将活化好的平滑菱形藻藻种置于无菌种子培养基中异养培养2-8天制成种子液，使平滑菱形藻细胞处于对数生长期；所述的平滑菱形藻藻种选自平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP559、平滑菱形藻(Nitzschialaevis)UTEX2047、平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP1092；所述的平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP559(购自美国海洋微藻和微生物保藏中心，NationalCenterforMarineAlgaeandMicrobiota，简称NCMA)、平滑菱形藻(Nitzschialaevis)UTEX2047(购自美国德克萨斯大学奥斯汀分校微藻保藏库，CultureCollectionofAlgaeatTheUniversityofTexasatAustin，简称UTEX)、平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP1092(购自美国海洋微藻和微生物保藏中心，NationalCenterforMarineAlgaeandMicrobiota，简称NCMA)，其中优选平滑菱形藻(Nitzschialaevis)UTEX2047；B、发酵培养将步骤A中平滑菱形藻细胞处于对数生长期的种子液按照体积比为3％-20％的接种量转接至装有无菌发酵培养基的反应釜进行通气发酵，通过流加营养组分培养的方式制备岩藻黄素发酵液，通气发酵过程中温度20℃-30℃，发酵周期4-14天，发酵培养基的溶氧不低于20％，pH＝6-9，发酵培养基的葡萄糖、硝酸盐、磷酸盐浓度分别为1-10g/L、0.1-1.5g/L和10-100mg/L；所述的流加营养组分包括碳源、氮源和磷源，其中碳源采用葡萄糖、果葡糖浆、淀粉水解物的一种或其组合，氮源采用硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、尿素、酵母膏、蛋白胨的一种或其组合，磷源采用磷酸钾及其水合物、磷酸氢钾及其水合物、磷酸二氢钾及其水合物、磷酸钠及其水合物、磷酸氢钠及其水合物、磷酸二氢钠及其水合物的一种或其组合。因从发酵液中分离平滑菱形藻细胞以及从平滑菱形藻细胞中提取岩藻黄素属于现有技术，申请人在此不再赘述。本专利技术的具体技术构思还有：为满足平滑菱形藻藻种不同生长阶段对于营养物质的需求，优选的技术实现手段是，所述的流加营养组分中碳源：氮源：磷源的质量比＝52-141∶5.6-21.1∶1。营养成分在流加时可以包括但不局限于采用如下方式，流加培养营养组分中的碳源、氮源、磷源采用按比例单独流加或至少其中两种成分以上复配的方式流加。为便于生产过程中的控制，简化工艺并缩短操作时间，优选的技术实现手段是，流加培养是将流加培养营养组分中的碳源、氮源、磷源采用按比例复配后制成补料液流加至反应釜内的发酵培养基中，补料液中碳源浓度以葡萄糖为标准，葡萄糖浓度为100g/L-500g/L，氮源及磷源浓度分别为22.7g/L-113.4g/L及3.3g/L-16.6g/L。为满足平滑菱形藻藻种的生长需要，便于终产物的积累，优选的技术实现手段如下：所述的种子培养基及发酵培养基包括如下含量的原料：碳源1g/L-20g/L；氮源0.3g/L-3g/L；磷酸盐40-1000mg/L；NaCl10g/L-32g/L；MgSO4·7H2O1.09g/L-2.18g/L；CaCl2·2H2O0.1g/L-0.27g/L；FeCl3·6H2O0.291mg/L-0.582mg/L；MnCl2·4H2O0.025mg/L-0.246mg/L；ZnCl20.031mg/L-0.311mg/L；CoCl2·6H2O0.0114mg/L-0.0228mg/L；Na2MoO4·2H2O0.012mg/L-0.024mg/L；H3BO33.06mg/L-30.56mg/L；(NH4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：A、种子液的制备将活化好的平滑菱形藻藻种置于无菌种子培养基中异养培养2‑8天制成种子液，使平滑菱形藻细胞处于对数生长期；所述的平滑菱形藻藻种选自平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP559、平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047、平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP 1092；B、发酵培养将步骤A中平滑菱形藻细胞处于对数生长期的种子液按照体积比为3％‑20％的接种量转接至装有无菌发酵培养基的反应釜进行通气发酵，通过流加营养组分培养的方式制备岩藻黄素发酵液，通气发酵过程中温度20℃‑30℃，发酵周期4‑14天，发酵培养基的溶氧不低于20％，pH＝6‑9，发酵培养基的葡萄糖、硝酸盐、磷酸盐浓度分别为1‑10g/L、0.1‑1.5g/L和10‑100mg/L；所述的流加营养组分包括碳源、氮源和磷源，其中碳源采用葡萄糖、果葡糖浆、淀粉水解物的一种或其组合，氮源采用硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、尿素、酵母膏、蛋白胨的一种或其组合，磷源采用磷酸钾及其水合物、磷酸氢钾及其水合物、磷酸二氢钾及其水合物、磷酸钠及其水合物、磷酸氢钠及其水合物、磷酸二氢钠及其水合物的一种或其组合。...

【技术特征摘要】
1.采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：A、种子液的制备将活化好的平滑菱形藻藻种置于无菌种子培养基中异养培养2-8天制成种子液，使平滑菱形藻细胞处于对数生长期；所述的平滑菱形藻藻种选自平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP559、平滑菱形藻(Nitzschialaevis)UTEX2047、平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP1092；B、发酵培养将步骤A中平滑菱形藻细胞处于对数生长期的种子液按照体积比为3％-20％的接种量转接至装有无菌发酵培养基的反应釜进行通气发酵，通过流加营养组分培养的方式制备岩藻黄素发酵液，通气发酵过程中温度20℃-30℃，发酵周期4-14天，发酵培养基的溶氧不低于20％，pH＝6-9，发酵培养基的葡萄糖、硝酸盐、磷酸盐浓度分别为1-10g/L、0.1-1.5g/L和10-100mg/L；所述的流加营养组分包括碳源、氮源和磷源，其中碳源采用葡萄糖、果葡糖浆、淀粉水解物的一种或其组合，氮源采用硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、尿素、酵母膏、蛋白胨的一种或其组合，磷源采用磷酸钾及其水合物、磷酸氢钾及其水合物、磷酸二氢钾及其水合物、磷酸钠及其水合物、磷酸氢钠及其水合物、磷酸二氢钠及其水合物的一种或其组合。2.根据权利要求1所述的采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于所述的流加营养组分中碳源：氮源：磷源的质量比＝52-141：5.6-21.1：1。3.根据权利要求2所述的采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于所述的流加培养营养组分中的碳源、氮源、磷源采用按比例单独流加或至少其中两种成分以上复配的方式流加。4.根据权利要求2所述的采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法，其特征在于流加培养是将流加培养营养组分中的碳源、氮源、磷源采用按比例复配后制成补料液流加至反应釜内的发酵培养基中，补料液中碳源浓度以葡萄糖为标准，葡萄糖浓度为100g/L-500g/L，氮源及磷源浓度分别为22.7g/L-113.4g/L及3.3g/L-16.6g/L。5.根据权利要求1所述的采用流加通气培养制备岩藻黄素发酵液的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宾，陈峰，卢雪，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11