一种卵黄抗体的快速提取方法、制备的抗流感产品及其应用技术

本发明专利技术公开了一种卵黄抗体的快速提取方法、制备的抗流感产品及其应用。包括以下步骤：四价流感疫苗H1N1、H3N2、B(Victoria)、B(Yamagata)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌全菌疫苗免疫蛋鸡；机械自动化分离鸡蛋获得卵黄，柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲液稀释并稳定卵黄液pH值；加入干冰快速降低体系温度；连续高速低温离心，去除脂颗粒，获得卵黄抗体上清液；将卵黄抗体上清液依次通过2‑6μm和0.3‑0.8μm双层滤膜、截留分子量为300kD中空纤维超滤膜去除杂蛋白、最后通过截留分子量为100kD中空纤维超滤膜获得浓缩卵黄抗体液；添加辅料制成口、鼻腔黏膜喷雾剂。本方法具有自动化程度高、能耗低、产量大、绿色环保、可实现大规模产业化生产等优点。

Fast extraction method of egg yolk antibody, prepared anti influenza product and application thereof

The invention discloses a fast extraction method of egg yolk antibody, a prepared anti influenza product and its application. It includes the following steps: immunizing laying hens with tetravalent influenza vaccines H1N1, H3N2, B (Victoria), B (Yamagata), Escherichia coli and Staphylococcus aureus whole-strain vaccines; isolating eggs mechanically and automatically to obtain yolk, diluting and stabilizing the pH value of yolk solution with disodium citric acid/hydrogen phosphate buffer solution; adding dry ice to rapidly reduce the temperature of the system; continuously isolating eggs. The yolk antibody supernatant was obtained by high-speed and low-temperature centrifugation. The yolk antibody supernatant was separated by 2.6 and 0.3_0.8 micron bilayer filtration membranes with a molecular weight of 300 kD, and then concentrated by the membrane with a molecular weight of 100 kD. Excipients are made into oral and nasal mucosa spray. This method has the advantages of high degree of automation, low energy consumption, large output, green environment protection, and large-scale industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一种卵黄抗体的快速提取方法、制备的抗流感产品及其应用
本专利技术属于生物医药
，尤其是通过免疫、饲养技术获取抗体并制备成药品或保健品的生物技术，特别涉及一种快速提取卵黄抗体的方法、提取的卵黄抗体制备的抗流感产品及其应用。
技术介绍
流感是一种由病毒引起急性呼吸道传染病，其特征表现为突然发烧，咳嗽，头痛，肌肉和关节疼痛，严重不适感，喉咙痛和流鼻涕等症状，主要通过接触及空气飞沫传播。目前，甲型流感病毒H1N1和H3N2亚型和乙型流感病毒B/Yamagata系和B/Victoria系为引起人类季节性流感的主要株型。目前通过接种疫苗进行预防，服用药物神经氨酸酶抑制剂和M2蛋白抑制剂进行治疗，由于现接种疫苗抗体不能识别新突变的病毒而使其效果降低，再者药物不良反应较多且易产生耐药性。卵黄抗体(ImmunoglobulinY，IgY)是指鸟类、两栖动物以及爬行动物的主要血清抗体，与哺乳动物IgG和IgE具有共同的祖先，在功能上IgY类似于IgG，目前，鸡IgY是应用最广泛的IgY，鸡体内有IgA、IgM、IgY三种抗体，IgY占总免疫球蛋白的75％。由于卵黄膜上特异性受体的选择性透过作用，使得IgY成为唯一能透过该膜而运输至卵黄中的抗体，通过向鸡免疫特定灭活病原体，机体将会产相应特异性抗体，将其提取并制成各种制品可应用于相应疾病的预防和治疗。IgY具有耐热、耐酸、抗离子强度的能力，自1980年起，IgY已在全球的各领域被应用，如医疗卫生、诊断试剂和生物标记物，尤其是在被动免疫方面的应用是最广泛的，目前IgY已成功应用于口腔疾病、咽喉炎、流感(H5N1)、鼻炎和鼻窦炎、非典型肺炎(SARS)、柯萨奇病毒性心肌炎、妇科感染、胃炎、艾滋病等粘膜性疾病的防治。通过向蛋鸡免疫四价流感病毒疫苗，便可从卵黄中分离出特异性IgY，用于季节性流感的防治。IgY是一种存在于单个鸡蛋里面的免疫球蛋白，要制备高纯度、高活性的IgY，则需简化生产工艺、减少外源试剂、缩短生产时间，以获得高回收率、高活性的IgY。现阶段的IgY提取方法中，大多数适用于实验室的小量提取。如：采用手工打蛋的方式来收集卵黄，效率较低，不适合大规模使用，且易引入污染源，增加卵黄抗体受污染的风险；采用重复冷冻和解冻1-3次的方式，如果运用到生产操作，则费时费力；使用辛酸或氯仿等有机溶剂提取IgY，有机溶剂的应用使IgY的活性受到影响，且有毒、污染环境，操作不便；采用硫酸铵盐析沉淀法，存在离心收集沉淀和复溶沉淀等耗时操作；采用水稀释提取法提取IgY，虽然适用大规模的生产和保护IgY的活性，但是延长了提取时间，需将料液放置在低温环境下8h以上，才能使其温度降低至0-8℃，在实际生产中该生产工艺耗时耗能，大规模产业化生产效率低。固体二氧化碳，俗称干冰，其温度可达-78.5℃，每单位体积具有相当于普通冰水3倍的冷却能量，在短时间内便可降低系统温度。干冰在常压下可由固态直接变为气态，而不经历液态，具有无残留性，目前已被成功应用于各行业，如：干冰清洁、干冰灭火、食品，医药冷冻运输以及制冷剂CFC的绿色替代物。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种高自动化、高效率、高纯度、高活性的卵黄抗体提取工艺，并将提取的特异性IgY在制备治疗或预防抗流感产品中应用，制备成口、鼻腔黏膜喷剂。本专利技术通过以下技术方案实现：卵黄抗体的提取方法，包括以下工艺方法：卵黄抗体的提取方法，其特征在于包括以下工艺方法：蛋鸡免疫：将灭活四价肠道病毒疫苗、细菌疫苗分别免疫两批蛋鸡；卵黄抗体IgY的提取：鸡蛋外壳消毒，机械分离卵清卵黄，收集卵黄并加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液进行稀释，再向其中加入干冰快速降低体系温度，离心除杂，收集卵黄抗体IgY上清液通过双层膜过滤系统除杂，收集透过液并通过二级超滤系统获得浓缩的IgY液。所述四价流感病毒疫苗是H1N1、H3N2、B(Victoria)和B(Yamagata)，浓度比为1:1:1:1d混合疫苗,细菌疫苗为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌浓度比为1:1的混合疫苗。所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液浓度是0.01-0.05M，pH值＝4.5-5.5，其加入量按照卵黄液：缓冲液重量比1:7-1:10加入进行稀释。所述干冰为加入卵黄缓冲混合液重量0.1-1％的固态干冰，然后静止1-3h，保持温度0-8℃。本专利技术卵黄抗体的提取方法具体步骤如下：蛋鸡免疫：选用流感株型H1N1、H3N2、B(Victoria)和B(Yamagata)疫苗免疫一批蛋鸡，甲醛灭活大肠杆菌和金黄色葡萄球菌制备全菌疫苗免疫另一批蛋鸡。卵黄抗体IgY的提取：分别提取灭活四价肠道病毒疫苗、细菌疫苗免疫的母鸡蛋；选用上述免疫抗原免疫的母鸡蛋，用75％乙醇喷洒鸡蛋表面进行消毒，送入蛋清蛋黄分离机，进行破壳和蛋清蛋黄分离，收集分离卵黄液并按下述步骤进行提取：(1)溶解，按照卵黄液：缓冲液重量比1:7-1:10进行混合并充分搅匀，获得卵黄酸化液；(2)降温，向步骤(1)的混合液中，加入其重量0.1-1％固态干冰，静止1-3h，保持温度0-8℃；(3)去杂，连续高速低温离心，通过乙二醇冷媒系统对离心系统降温，保持离心温度0-8℃，转速14,000r/min，离心分离酸化液，去除脂颗粒，收集离心后上清液；(4)膜过滤，将收集的上清液依次通过孔径2-6μm和孔径0.3-0.8μm的双层滤膜，收集过滤液；(5)一级超滤，将步骤(4)得到的过滤液通过截留分子量为300kD的中空纤维超滤膜，收集透析端透析液，(6)二级超滤，将步骤(5)得到的透析液通过截留分子量为100kD的中空纤维超滤膜进行浓缩，获得浓度为透析液15-20倍的卵黄抗体IgY浓缩液。本专利技术将上述提取得到的卵黄抗体IgY浓缩液应用于制备治疗和预防抗流感产品中。本专利技术所述卵黄抗体制备的抗流感产品，包含上述提取得到的卵黄抗体IgY浓缩液；包括四价流感病毒特异性卵黄抗体IgY、抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌特异性卵黄抗体IgY，上述病毒、细菌提取得到的卵黄抗体IgY按照质量比3:1进行混合，卵黄抗体IgY总浓度为1200-2000ug/mL。上述产品是包含甜味剂、食用香精和蛋白质稳定剂的喷雾剂。所述甜味剂是蔗糖、三氯蔗糖、甜菊糖中的一种或多种；食用香精是西瓜香精、草莓香精和薄荷香精中的一种或多种。所述蛋白质稳定剂是甘氨酸，添加量为总重量的0.05-0.5％。本专利技术得到的是超浓缩的卵黄抗体液，蛋白含量(4-7mg/mL)，可直接或进一步处理添加到食品或药品中进行使用。与现有“卵黄抗体流感产品”不同，本专利技术为四价流感病毒抗体，相对市场供应的三价疫苗，本专利技术抗病毒类型更广，此外本专利技术产品中包含抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的特异性IgY，可抑制流感继发的细菌性上呼吸道感染。与现有技术“人工分离蛋清蛋黄”相比，本专利技术采用“机械自动化分离蛋清蛋黄”，提高了生产效率，缩短了卵黄的收集时间，减少了手工劳动量，降低了人为污染机会；与现有技术“水稀释卵黄液”相比，本专利技术采用“0.01-0.05M柠檬酸-磷酸氢二钠(pH值＝5.0±0.5)”缓冲液稀释卵黄，pH值严格控制在IgY等电点(pH值＝5.7-7.6)以下，IgY可极大限度地溶于该缓冲液，并且在该缓冲液中IgY具有稳定的生物活性；另外，与现有技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于包括以下工艺方法：蛋鸡免疫：将甲醛灭活的四价流感病毒疫苗、细菌疫苗分别免疫两批蛋鸡；卵黄抗体IgY的提取：鸡蛋外壳消毒，机械分离卵清卵黄，收集卵黄并加入柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲液进行稀释，再向其中加入干冰快速降低体系温度，离心除杂，收集卵黄抗体IgY上清液通过双层膜过滤系统除杂，收集透过液并通过二级超滤系统获得浓缩的IgY液。

【技术特征摘要】
1.一种卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于包括以下工艺方法：蛋鸡免疫：将甲醛灭活的四价流感病毒疫苗、细菌疫苗分别免疫两批蛋鸡；卵黄抗体IgY的提取：鸡蛋外壳消毒，机械分离卵清卵黄，收集卵黄并加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液进行稀释，再向其中加入干冰快速降低体系温度，离心除杂，收集卵黄抗体IgY上清液通过双层膜过滤系统除杂，收集透过液并通过二级超滤系统获得浓缩的IgY液。2.根据权利要求1所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于：所述四价流感病毒灭活疫苗是H1N1、H3N2、B(Victoria)和B(Yamagata)，浓度比为1:1:1:1混合疫苗，细菌疫苗为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌浓度比为1:1的混合疫苗。3.根据权利要求2所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于：所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液浓度是0.01-0.05M，pH值＝4.5-5.5，其加入量按照卵黄液：缓冲液重量比1:7-1:10加入进行稀释。4.根据权利要求3所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于：所述干冰为加入卵黄缓冲混合液重量0.1-1％的固态干冰，然后静止1-3h，保持温度0-8℃。5.根据权利要求4所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于具体步骤包括：蛋鸡免疫：选用株型H1N1、H3N2、B(Victoria)、B(Yamagata)疫苗免疫一批蛋鸡，甲醛灭活大肠杆菌和金黄色葡萄球菌制备全菌疫苗免疫另一批蛋鸡。卵黄抗体IgY的提取：分别提取灭活四价流感病毒疫苗、细菌疫苗免疫的母鸡蛋；选用上述免疫抗原免疫的母鸡蛋，用75％乙醇喷洒鸡蛋表面进行消毒，送入蛋清蛋黄分离机，进行破壳和蛋清蛋黄分离，收集分离卵黄液并按下述步骤进行提取：(1)溶解，按照卵黄液：缓冲液重量比1:7-1:10进行混合并充分搅匀，获得卵...

【专利技术属性】
技术研发人员：林小军，
申请(专利权)人：成都安蒂康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51