一种卵黄抗体的快速提取方法、制备的抗手足口病产品及其应用技术

本发明专利技术公开了一种快速提取卵黄抗体及其在制备抗手足口病产品中的应用。包括：四价肠道病毒疫苗EV71、CoxA16、CoxA10、CoxA6、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌全菌疫苗免疫蛋鸡；机械自动化分离鸡蛋获得卵黄，柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲液稀释并稳定卵黄液pH值；加入干冰快速降低体系温度；连续高速低温离心，去除脂颗粒，获得卵黄抗体上清液；将卵黄抗体上清液依次通过2‑6μm和0.3‑0.8μm双层滤膜、截留分子量为300kD中空纤维超滤膜去除杂蛋白、最后通过截留分子量为100kD中空纤维超滤膜获得浓缩卵黄抗体液；添加辅料制成皮肤及口、鼻腔黏膜喷剂。本方法具有自动化程度高、能耗低、产量大、绿色环保、可实现大规模产业化生产等优点。

A fast extraction method of yolk antibody, preparation of anti HFMD products and its application

The invention discloses a rapid extraction of egg yolk antibody and its application in the preparation of anti HFMD products. Including: EV71, CoxA16, CoxA10, CoxA6, Escherichia coli and Staphylococcus aureus whole-strain vaccine immunized laying hens; egg yolk obtained by mechanical automatic isolation, diluted with disodium citrate phosphate buffer and stabilized the pH value of yolk solution; adding dry ice to rapidly reduce the system temperature; continuous high-speed low-temperature isolation The yolk antibody supernatant was obtained by removing lipid particles, then the yolk antibody supernatant was obtained by 2_6_m and 0.3_0.8_m bilayer filtration membranes, 300 kD hollow fiber ultrafiltration membranes, and then concentrated yolk antibody solution was obtained by 100 kD hollow fiber ultrafiltration membranes. Skin, mouth and nasal mucosa spray. This method has the advantages of high degree of automation, low energy consumption, large output, green environment protection, and large-scale industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一种卵黄抗体的快速提取方法、制备的抗手足口病产品及其应用
本专利技术属于生物医药
，尤其是通过免疫、饲养技术获取抗体并制备成药品或保健品的生物技术，特别涉及一种快速提取卵黄抗体的方法、提取的卵黄抗体制备的抗手足口病产品及其应用。
技术介绍
手足口病是一种常见于5岁以下少儿的传染性疾病，其病例特征表现为发热3-4天，随后手掌和足底皮肤，口腔粘膜和舌头表现出囊泡症状。该病主要由柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)为主的20多种肠道病毒引起。目前，该疾病缺乏有效治疗药物主要对症治疗。卵黄抗体(ImmunoglobulinY，IgY)是指鸟类、两栖动物以及爬行动物的主要血清抗体，与哺乳动物IgG和IgE具有共同的祖先，在功能上IgY类似于IgG，目前，鸡IgY是应用最广泛的IgY，鸡体内有IgA、IgM、IgY三种抗体，IgY占总免疫球蛋白的75％。由于卵黄膜上特异性受体的选择性透过作用，使得IgY成为唯一能透过该膜而运输至卵黄中的抗体，通过向鸡免疫特定灭活病原体，机体将会产相应特异性抗体，将其提取并制成各种制品可应用于相应疾病的预防和治疗。IgY具有耐热、耐酸、抗离子强度的能力，自1980年起，IgY已在全球的各领域被应用，如医疗卫生、诊断试剂和生物标记物，尤其是在被动免疫方面的应用是最广泛的，目前IgY已成功应用于口腔疾病、咽喉炎、流感(H5N1)、鼻炎和鼻窦炎、非典型肺炎(SARS)、柯萨奇病毒性心肌炎、妇科感染、胃炎、艾滋病等粘膜性疾病的防治。通过向蛋鸡免疫四价肠道病毒疫苗，便可从卵黄中分离出特异性IgY，用于手足口疾病的防治，由于IgY的天然无毒副作用性质，尤其适用于体抗力较差的婴幼儿患者。其次，IgY被动免疫可以弥补主动免疫(接种疫苗)耗时长的缺点。IgY是一种存在于单个鸡蛋里面的免疫球蛋白，要制备高纯度、高活性的IgY，则需简化生产工艺、减少外源试剂、缩短生产时间，以获得高回收率、高活性的IgY。现阶段的IgY提取方法中，大多数适用于实验室的小量提取。如：(1)采用手工打蛋的方式来收集卵黄，效率较低，不适合大规模使用，且易引入污染源，增加卵黄抗体受污染的风险；(2)采用重复冷冻和解冻1-3次的方式，如果运用到生产操作，则费时费力；(3)使用辛酸或氯仿等有机溶剂提取IgY，有机溶剂的应用使IgY的活性受到影响，且有毒、污染环境，操作不便；(4)采用硫酸铵盐析沉淀法，存在离心收集沉淀和复溶沉淀等耗时操作；(5)采用水稀释提取法提取IgY，虽然适用大规模的生产和保护IgY的活性，但是延长了提取时间，需将料液放置在低温环境下8h以上，才能使其温度降低至0-8℃，在实际生产中该生产工艺耗时耗能，大规模产业化生产效率低。固体二氧化碳，俗称干冰，其温度可达-78.5℃，每单位体积具有相当于普通冰水3倍的冷却能量，在短时间内便可降低系统温度。干冰在常压下可由固态直接变为气态，而不经历液态，具有无残留性，目前已被成功应用于各行业，如：干冰清洁、干冰灭火、食品，医药冷冻运输以及制冷剂CFC的绿色替代物。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种高自动化、高效率、高纯度、高活性的卵黄抗体提取工艺，并将提取的特异性IgY在制备治疗或预防抗手足口病产品中应用，制备成口、鼻腔黏膜喷剂。本专利技术通过以下技术方案实现：卵黄抗体的快速提取方法，包括以下工艺方法：蛋鸡免疫：将灭活四价肠道病毒疫苗或细菌疫苗分别免疫两批蛋鸡；卵黄抗体IgY的提取：鸡蛋外壳消毒，机械分离卵清卵黄，收集卵黄并加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液进行稀释，再向其中加入干冰快速降低体系温度，离心除杂，收集卵黄抗体IgY上清液通过双层膜过滤系统除杂，收集透过液并通过二级超滤系统获得浓缩的IgY液。所述四价肠道病毒灭活疫苗为EV71型、CoxA16型、CoxA10型和CoxA6型浓度比为1:1:1:1的混合疫苗，细菌疫苗为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌浓度比为1:1的混合疫苗。所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液浓度是0.01-0.05M，pH值＝4.5-5.5，其加入量按照卵黄液：缓冲液重量比1:7-1:10加入进行稀释。所述干冰为加入卵黄缓冲混合液重量0.1-1％的固态干冰，然后静止1-3h，保持温度0-8℃。本专利技术卵黄抗体的提取方法具体步骤如下：蛋鸡免疫：选用WHO推荐用株型EV71、CoxA16、CoxA10、CoxA6疫苗免疫一批蛋鸡，甲醛灭活的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌全菌疫苗免疫另一批蛋鸡；卵黄抗体IgY的提取：分别提取灭活四价肠道病毒疫苗、细菌疫苗免疫的母鸡蛋；选用上述免疫抗原免疫的母鸡蛋，用75％乙醇喷洒鸡蛋表面进行消毒，送入蛋清蛋黄分离机，进行破壳和蛋清蛋黄分离，收集分离卵黄液并按下述步骤进行提取：(1)溶解，按照卵黄液：缓冲液重量比1:7-1:10进行混合并充分搅匀，获得卵黄酸化混合液；(2)降温，向步骤(1)的混合液中，加入混合液重量0.1-1％固态干冰，静止1-3h，保持温度0-8℃；(3)去杂，连续高速低温离心，通过乙二醇冷媒系统对离心系统降温，保持离心温度0-8℃，转速14,000r/min，离心分离酸化液，去除脂颗粒，收集离心后上清液；(4)膜过滤，将收集的上清液依次通过孔径2-6μm和孔径0.3-0.8μm的双层滤膜，收集过滤液；(5)一级超滤，将步骤(4)得到的过滤液通过截留分子量为300kD的中空纤维超滤膜，收集透析端透析液；(6)二级超滤，将步骤(5)得到的透析液通过截留分子量为100kD的中空纤维超滤膜进行浓缩，获得浓度为透析液15-20倍的卵黄抗体IgY浓缩液。本专利技术将上述提取得到的卵黄抗体IgY浓缩液应用于制备治疗和预防抗手足口病产品中。本专利技术所述卵黄抗体制备的抗手足口病产品，包含上述提取得到的卵黄抗体IgY浓缩液；包括：四价肠道病毒特异性卵黄抗体IgY、抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌特异性卵黄抗体IgY；上述病毒、细菌提取得到的卵黄抗体IgY按照质量比3:1进行混合，卵黄抗体IgY总浓度为1200-2000ug/mL。上述产品是包含甜味剂、食用香精和蛋白质稳定剂的喷剂。所述甜味剂是蔗糖、三氯蔗糖、甜菊糖中的一种或多种；食用香精是西瓜香精、草莓香精和薄荷香精中的一种或多种。所述蛋白质稳定剂是甘氨酸，添加量为总重量的0.05-0.5％。本专利技术得到的是超浓缩的卵黄抗体液，蛋白含量(4-7mg/mL)，可直接或进一步处理添加到食品或药品中进行使用。与现有手足口病疫苗制剂相比，本专利技术包含抗EV71、CoxA16、CoxA10、CoxA6四型的特异性IgY，此外本专利技术产品中包含抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的特异性IgY，可抑制粘膜疱疹或破溃后形成溃疡的细菌性感染。与现有技术“人工分离蛋清蛋黄”相比，本专利技术采用“机械自动化分离蛋清蛋黄”，提高了生产效率，缩短了卵黄的收集时间，减少了手工劳动量，降低了人为污染机会；与现有技术“水稀释卵黄液”相比，本专利技术采用“0.01-0.05M柠檬酸-磷酸氢二钠(pH值＝5.0±0.5)”缓冲液稀释卵黄，pH值严格控制在IgY等电点(pH值＝5.7-7.6)以下，IgY可极大限度地溶于该缓冲液，并且在该缓冲液中IgY具有稳定的生物活性；另外，与现有技术不同，本专利技术采取向卵黄液里加入固态干冰的方式，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于包括以下工艺方法：蛋鸡免疫：将甲醛灭活四价肠道病毒疫苗、细菌疫苗分别免疫两批蛋鸡；卵黄抗体IgY的提取：鸡蛋外壳消毒，机械分离卵清卵黄，收集卵黄并加入柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲液进行稀释，再向其中加入干冰快速降低体系温度，离心除杂，收集卵黄抗体IgY上清液通过双层膜过滤系统除杂，收集透过液并通过二级超滤系统获得浓缩的IgY液。

【技术特征摘要】
1.一种卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于包括以下工艺方法：蛋鸡免疫：将甲醛灭活四价肠道病毒疫苗、细菌疫苗分别免疫两批蛋鸡；卵黄抗体IgY的提取：鸡蛋外壳消毒，机械分离卵清卵黄，收集卵黄并加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液进行稀释，再向其中加入干冰快速降低体系温度，离心除杂，收集卵黄抗体IgY上清液通过双层膜过滤系统除杂，收集透过液并通过二级超滤系统获得浓缩的IgY液。2.根据权利要求1所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于：所述四价肠道病毒灭活疫苗为EV71型、CoxA16型、CoxA10型和CoxA6型浓度比为1:1:1:1的混合疫苗，细菌疫苗为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌浓度比为1:1的混合疫苗。3.根据权利要求2所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于：所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液浓度是0.01-0.05M，pH值＝4.5-5.5，其加入量按照卵黄液：缓冲液重量比1:7-1:10加入进行稀释。4.根据权利要求3所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于：所述干冰是加入卵黄缓冲混合液重量0.1-1％的固态干冰，然后静止1-3h，保持温度0-8℃。5.根据权利要求4所述的卵黄抗体的快速提取方法，其特征在于具体步骤包括：蛋鸡免疫：选用株型EV71、CoxA16、CoxA10、CoxA6疫苗免疫一批蛋鸡，甲醛灭活的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌全菌疫苗免疫另一批蛋鸡；卵黄抗体IgY的提取：分别提取灭活四价肠道病毒疫苗、细菌疫苗免疫的母鸡蛋；选用上述免疫抗原免疫的母鸡蛋，用75％乙醇喷洒鸡蛋表面进行消毒，送入蛋清蛋黄分离机，进行破壳和蛋清蛋黄分离，收集分离卵黄液并按下述步骤进行提取：(1)溶解，按照卵黄液：缓冲液重量比1:7-1:10进行混合并充分搅匀，获得卵黄酸化混合液；(2)降温，向...

【专利技术属性】
技术研发人员：林小军，
申请(专利权)人：成都安蒂康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51