一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及制备方法，所述的注射液包括数量为5×105‑2×106个/mL的激活的间充质干细胞、质量体积比为1％‑5％的人血白蛋白、质量体积比为1％‑8％的甘露醇注射液、质量体积比为1％‑5％的复方维生素注射液、质量体积比为1％‑5％的50％葡萄糖注射液以及余量的生理盐水。本发明专利技术公开的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液在脑缺血后炎症损伤过程中会释放TNF‑α，IL‑1，IL‑6等促炎性因子，用于输注治疗缺血性脑卒中。

Mesenchymal stem cell injection for treating ischemic stroke and preparation method thereof

The invention discloses a mesenchymal stem cell injection for treating ischemic stroke and a preparation method thereof. The injection comprises an activated mesenchymal stem cell with a quantity of 5 *105_2 106/ml, a human serum albumin with a mass-volume ratio of 1%5%, a mannitol injection with a mass-volume ratio of 1%8%, and a mass-volume ratio of 1%8%. Compound vitamin injection with a ratio of 1%5%, 50% glucose injection with a mass-volume ratio of 1%5% and residual saline. The mesenchymal stem cell injection for treating ischemic stroke disclosed in the present invention can release TNF_alpha, IL_1, IL_6 and other pro-inflammatory factors in the process of inflammation injury after cerebral ischemia, and is used for infusion treatment of ischemic stroke.

【技术实现步骤摘要】
一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及制备方法
本专利技术涉及细胞生物学
，更具体地说，本专利技术涉及一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及制备方法。
技术介绍
缺血性中风是中风中最常见类型，它是由于脑内血流阻断，脑内缺血缺氧造成神经损伤，可引发长期或永久性残疾。缺血性中风的现有治疗选择很有限，仅有的选择包括溶栓剂如tPA，或者外科机械取栓再灌注手术，而且这些手段都最好是限定在中风发生后几小时(3-6h)内实施，才有可能取得疗效。很多患者因为种种原因，时常错过了这个极为短暂的最佳治疗时间窗口，最后无奈只能简单地接受支持性或姑息性护理。中风的长期医疗成本是巨大的，许多患者需要延长住院治疗、长期理疗或康复治疗，并可能需要长期的机构护理或家庭护理。间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)存在于几乎所有的组织中，并且可以从骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘和羊膜液中分离出。MSCs不仅具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，还具有免疫调控能力和低的免疫原性等特性，是移植领域应用前景广阔的再生来源细胞，也因此受到越来越多的生物学领域科学家和医学研究人员的青睐；越来越多的研究证实间充质干细胞(MSCs)通过分泌的细胞因子可发挥免疫调节与降低炎症的作用。缺血性脑卒中是一个复杂的病例过程，炎症反应与脑缺血损伤关系密切。诸多细胞因子产生的过程和作用并不相同，在致炎因子占主导地位时，对脑缺血产生保护作用，通过调节不同细胞因子的表达水平，抑制炎症反应的治疗可能具有潜在的临床价值。研究发现，间充质干细胞可以缓解炎症反应，它的这种促进炎症到增殖阶段转变的生物属性，在严重的炎症抑制治疗中是非常重要的。因此，间充质干细胞越来越广泛的被应用于治疗炎性相关疾病之中。然而，由于MSCs受体内环境的影响，治疗效果不确定，因此目前干细胞对炎症的修复技术是仍是亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供了一种用于缓解急性炎症和用于治疗缺血性脑卒的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及其制备方法。为了实现上述目的，本专利技术公开了一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液，包括以下组分：数量为5×105-2×106个/mL的激活的间充质干细胞、质量体积比为1％-5％的人血白蛋白、质量体积比为1％-8％的甘露醇注射液、质量体积比为1％-5％的复方维生素注射液、质量体积比为1％-5％的50％葡萄糖注射液以及余量的生理盐水。优选地，本专利技术中，所述激活的间充质干细胞为TNF-α激活的间充质干细胞、IL-1激活的间充质干细胞及TNF-α和IL-1同时激活的间充质干细胞中的任意一种。优选地，本专利技术中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种。本专利技术公开了一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，包括如下步骤：步骤一、制备间充质干细胞，并培养第四代间充质干细胞；步骤二、将第四代间充质干细胞培养至70％-80％融合，制备激活的间充质干细胞；步骤三、按照权利要求1所述的配方，配制并称取质量体积比为1％-5％的人血白蛋白、质量体积比为1％-8％的甘露醇注射液、质量体积比为1％-5％的复方维生素注射液、质量体积比为1％-5％的50％葡萄糖注射液，并混匀；步骤四、将数量为5×105-2×106个/mL的激活的间充质干细胞重悬于步骤三混匀后的液体中，并加入余量的生理盐水，制备得到治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液。优选地，本专利技术中，所述步骤二中，所述激活的间充质干细胞的制备过程为：将第四代间充质干细胞培养至70-80％的融合，抽掉第四代间充质干细胞培养时使用的间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗第四代间充质干细胞；用特定的培养基培养第四代间充质干细胞；当第四代间充质干细胞的浓度达到5×105-2×106个/mL时，得到激活的间充质干细胞。优选地，本专利技术中，当所述激活的间充质干细胞为TNF-α激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为20ng/mL的TNF-α的α-MEM的培养基；当所述激活的间充质干细胞为IL-1激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为50ng/mL的IL-1的α-MEM的培养基；当所述激活的间充质干细胞为TNF-α和IL-1同时激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为20ng/mL的TNF-α培养基和浓度为50ng/mL的IL-1的α-MEM的培养基。优选地，本专利技术中，所述步骤一中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，且第四代脐带间充质干细胞的培养过程为：a)、取新鲜足月健康胎儿脐带，用含2倍100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍，剥离华尔通氏胶，将剥离后的华尔通氏胶剪成小于1mm3的小块；b)、将剪碎的华尔通氏胶均匀涂布于细胞培养器的底部，向所述细胞培养器中缓慢加入10mL无血清培养基，置于37℃、5v/v％CO2、饱和湿度环境中培养，将原代细胞培养7天后，更换无血清培养液，培养至细胞达到70％的融合，移去无血清培养液，添加浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸钠消化1min，脐带间充质干细胞收缩脱离瓶壁，此时加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA溶液，并使用移液管轻轻吹打，将脐带间充质干细胞悬液移入50mL离心管，离心后除去上清液，重新加入无血清完全培养基将离心后的脐带间充质干细胞重悬；c)、按照1传1.5接种10cm培养皿，脐带间充质干细胞培养融合70％时按照所述b)的操作过程传代培养，培养成第四代脐带间充质干细胞。优选地，本专利技术中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，第四代骨髓间充质干细胞的培养过程为：1)、于髂前上棘穿刺点，用骨穿针抽取50mL骨髓液，注入50mL的无菌离心管中；用等量含20μ/mL肝素的PBS液稀释，并沿无菌离心管的管壁加入等体积的比重为1.073g/mL的淋巴细胞分离液进行离心，离心转速为2000rpm，离心时间为30min，离心后吸取单个核细胞层；然后用无菌生理盐水离心洗涤2次，每次离心过程的转速为1000rpm，离心时间为5min，弃去上清液，取沉淀；2)、将离心得到的沉淀用无血清培养基混悬，计数细胞，按5×106个/mL接种于的培养瓶中，置37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养；培养3天后，更换无血清培养液，弃去未贴壁细胞，以后每3天1次更换培养液；7-9天后，骨髓间充质干细胞融合达50％-60％时，进行第一次传代；移去无血清培养液，采用浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-EDTA37℃消化1min，骨髓MSC收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA，并使用移液管轻轻吹打，将骨髓间充质细胞悬液移入50mL无菌离心管中；1000rpm离心8min，弃去上清液；重新加入无血清完全培养基重悬，计数；3)、按照1传1-1.5接种10cm培养皿；骨髓间充质干细胞培养融合60％-80％时，按照所述2)的操作过程进行传代培养。优选地，本专利技术中，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，第四代脂肪间充质干细胞的培养过程为：S1、分离腹部白色脂肪组织，剔除可见微血管及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液，其特征在于，包括以下组分：数量为5×105‑2×106个/mL的激活的间充质干细胞、质量体积比为1％‑5％的人血白蛋白、质量体积比为1％‑8％的甘露醇注射液、质量体积比为1％‑5％的复方维生素注射液、质量体积比为1％‑5％的50％葡萄糖注射液以及余量的生理盐水。

【技术特征摘要】
1.一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液，其特征在于，包括以下组分：数量为5×105-2×106个/mL的激活的间充质干细胞、质量体积比为1％-5％的人血白蛋白、质量体积比为1％-8％的甘露醇注射液、质量体积比为1％-5％的复方维生素注射液、质量体积比为1％-5％的50％葡萄糖注射液以及余量的生理盐水。2.根据权利要求1所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述激活的间充质干细胞为TNF-α激活的间充质干细胞、IL-1激活的间充质干细胞及TNF-α和IL-1同时激活的间充质干细胞中的任意一种。3.根据权利要求2所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种。4.一种根据权利要求1～3任一项所述的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、制备间充质干细胞，并培养第四代间充质干细胞；步骤二、将第四代间充质干细胞培养至70％-80％融合，制备激活的间充质干细胞；步骤三、按照权利要求1所述的配方，配制并称取质量体积比为1％-5％的人血白蛋白、质量体积比为1％-8％的甘露醇注射液、质量体积比为1％-5％的复方维生素注射液、质量体积比为1％-5％的50％葡萄糖注射液，并混匀；步骤四、将数量为5×105-2×106个/mL的激活的间充质干细胞重悬于步骤三混匀后的液体中，并加入余量的生理盐水，制备得到治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液。5.根据权利要求4所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述激活的间充质干细胞的制备过程为：将第四代间充质干细胞培养至70-80％的融合，抽掉第四代间充质干细胞培养时使用的间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗第四代间充质干细胞；用特定的培养基培养第四代间充质干细胞；当第四代间充质干细胞的浓度达到5×105-2×106个/mL时，得到激活的间充质干细胞。6.根据权利要求5所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，当所述激活的间充质干细胞为TNF-α激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为20ng/mL的TNF-α的α-MEM的培养基；当所述激活的间充质干细胞为IL-1激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为50ng/mL的IL-1的α-MEM的培养基；当所述激活的间充质干细胞为TNF-α和IL-1同时激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为20ng/mL的TNF-α培养基和浓度为50ng/mL的IL-1的α-MEM的培养基。7.根据权利要求4所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，且第四代脐带间充质干细胞的培养过程为：a)、取新鲜足月健康胎儿脐带，用含2倍100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍，剥离华尔通氏胶，将剥离后的华尔通氏胶剪成小于1mm3的小块；b)、将剪碎的华尔通氏胶均匀涂布于细胞培养器的底部，向所述细胞培养器中缓慢加入10mL无血清培养基，置于37℃、5v/v％CO2、饱和湿度环境中培养，将原代细胞培养7天后，更换无血清培养液，培...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝好杰，徐瑛，李梓源，陈惠华，周严恒，易军，
申请(专利权)人：北京宝韵杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11