一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，该方法包括：从新鲜收集的尿液中提取并纯化exosome，收集沉淀并重悬得到exosome悬液；分别用CD13和podocalyxin包被的磁珠对步骤(1)得到的exosome悬液进行分选，得到exosome分选液；将分选液通过用BCA试剂盒测exosome的蛋白浓度；根据蛋白浓度，将各分选液制备为蛋白上样标本，将标本进行CD13、Podocalyxcin和CD63westernblot检测后，鉴定得到所需的蛋白标记物。本发明专利技术能够分别提取尿液中podocalyxin和CD13阳性的exosome，有助于进一步对其开展分析和检测，从而精准的反映疾病状态下足细胞和近端肾小管上皮细胞的变化，为疾病诊治提供生物标志物。

【技术实现步骤摘要】
一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法
本专利技术属于医疗检测
，尤其涉及一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法。
技术介绍
近年来，各种急慢性肾损伤的发病率呈逐年增高趋势，其中近1％的患者在住院期间并发急性肾损伤，而慢性肾脏病的患病人数更以亿计，成为国人死亡的重要原因。早期诊断和针对性治疗是防治急性肾损伤并延缓慢性肾脏病进展的关键。但是，传统肾损伤诊断方法较差的灵敏度以及新肾损伤生物标志物欠佳的诊断准确性，使得人们无法及时、准确地确定是否发生肾脏损伤及其程度、病理类型、病变进展与预后等，因而失去有效防治肾损伤的时机。作为肾脏生理功能的产物，尿液的“质量”是反映肾脏功能最好的指标。随着尿液流经肾单位，其必定留有各段细胞的特征。分析尿液历来是人们窥探肾功能、诊断肾脏病的重要手段，有着血液检查和肾活检等无可比拟的优势，比如其可行性、无创性、便捷性和可重复性等。外泌体exosomes是一种由细胞产生，直径30～100nm的微小囊泡。来源细胞的生物信息以蛋白质、脂质和核酸的形式包含在exosomes当中，exosomes可谓是细胞状态的鲜活缩影。尿液exosomes主要来自于肾单位，并可能携带各段上皮细胞的特异性蛋白，其成分随细胞状态发生动态变化。肾损伤后，出现生化指标异常之前，细胞的病变很可能早已在exosomes的成分中有所体现，如尿液exosomes中Fetuin-A和NGAL分别提示急性肾损伤和移植肾的恢复延迟；FSGS、糖尿病等足细胞损伤时，尿液exosomes中WT1、podocalyxin、podoplanin等足细胞特异性蛋白增高，甚至比白蛋白尿更早出现；遗传性肾脏疾病，包括Bartter综合征、Gittelman's综合征，患者尿液exosomes中分别缺失Na-K-Cl和Na-Cl共转运体。因此，尿液exosomes很可能成为早期诊断肾损伤的生物标志物。尿液exosomes在肾损伤的发病、诊断、预后，乃至治疗上均发挥重要作用，具有极高的应用前景。尽管尿液exosomes大都来自于肾单位，然而其来源细胞仍然多种多样，在不加以区分的情况下分析尿液exosome的变化缺乏特异性，因而对疾病的诊断意义较差。利用exosomes表面的特异蛋白，通过分选技术，分离特定细胞来源的exosomes，并对其进行成分分析，才能真正达到单细胞活检，对于实现真正意义上细胞层面的诊断将更具有现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，旨在为鉴定蛋白生物标志物提供物质基础、为实时反映细胞状态提供可行途径。本专利技术是这样实现的，一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，该方法包括以下步骤：(1)从新鲜收集的尿液中提取并纯化exosome，收集沉淀并重悬得到exosome悬液；(2)分别用CD13和podocalyxin包被的磁珠对步骤(1)得到的exosome悬液进行分选，得到exosome分选液；(3)将步骤(2)得到的分选液通过用BCA试剂盒测exosome的蛋白浓度；(4)根据步骤(3)得到的蛋白浓度，将各分选液制备为蛋白上样标本，将所述标本进行CD13、Podocalyxcin和CD63westernblot检测后，鉴定得到所需的蛋白标记物。优选地，步骤(1)的详细步骤包括：(i)往新鲜尿液中加入蛋白酶抑制剂混合物，在4℃、17000g下离心10分钟，收集上清；所述尿液、蛋白酶抑制剂混合物的体积比为50mL：4.22mL；在步骤(i)中，所述蛋白酶抑制剂混合物包括100mMNaN3、10mMPMSF、1mMLeupeptin；(ii)将步骤(i)中得到的上清在25℃、200000g下离心1小时，收集沉淀；在步骤(iii)中，所述蔗糖分离溶液包括10mMTriethanolamine、250mMSucrose；(iii)将步骤(ii)中得到的沉淀用蔗糖分离溶液重悬后得到初级重悬液，按200mg/mL的浓度在重悬液中加入二硫苏糖醇，在95℃下加热2分钟，在25℃、200000g下离心1小时，收集的沉淀用蔗糖分离溶液重悬后得到exosome悬液。优选地，步骤(2)的详细步骤包括：(i)将20μL涡旋处理后的免疫包被磁珠与200μL分选缓冲液混匀后置于磁场环境中1分钟，弃上清，加入步骤(1)得到的exosome悬液；(ii)将exosome悬液在4℃下缓慢旋转孵育18～24小时，加入300μL分选缓冲液，轻拍混匀后置于磁场环境中1分钟，弃上清，加入400μL分选缓冲液，轻拍混匀后置于磁场环境中1分钟，加分选缓冲液重悬，得到exosome分选液；在步骤(i)、(ii)中，所述分选缓冲液为质量浓度为0.1％的BSA。优选地，步骤(3)的详细步骤包括：(i)将步骤(2)得到的exosome分选液与RIPA裂解液按体积1:1混匀，冰上放置30分钟，得到样本；在步骤(i)中，所述RIPA裂解液包括：50mM、pH7.4的PBS，质量浓度1％的NP40，质量浓度0.1％的SDS，100g/mLPMSF，质量浓度0.5％的脱氧胆酸钠，1mM钒酸钠，2μg/mLaprotinin，2μg/mLantipain，以及2μg/mLleupeptin；(ii)用BCA试剂盒测exosome的蛋白浓度，即加入蛋白标准品、样本或ddH2O各10μL孔，蛋白标准品浓度分别为1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL，加入(A+B)混合液200μL/孔，56℃孵育30分钟，570nm读取OD值，通过标准曲线计算蛋白浓度；在步骤(ii)中，所述(A+B)混合液中A、B的体积比为50：1。优选地，步骤(4)的详细步骤包括：依据蛋白浓度，往分选液中加入4×SSB上样缓冲液，混匀后100℃加热10分钟，制成蛋白上样标本；将蛋白上样标本进行CD13、Podocalyxcin和CD63westernblot检测。优选地，所述上样缓冲液包括：62.5mM、pH6.8的Tris-HCl，质量浓度2％的SDS，质量浓度10％的甘油，50mMDTT，质量浓度1％的溴酚蓝。本专利技术克服现有技术的不足，提供一种对尿液中近端肾小管上皮细胞和足细胞来源的exosome的蛋白标记物进行分选、检测的方法。本专利技术从人尿液中提取并纯化exosome，通过电镜观察其形态，NanoSightLM10分析大小分布；Westernblot鉴定其标志蛋白。经分析鉴定确认后，分别用近端肾小管上皮细胞和足细胞特异性抗体CD13和podocalyxin包被的磁珠吸附上述两种细胞来源的exosome，然后进行蛋白定量及Westernblot，鉴定出所需的蛋白标记物。本专利技术以尿液为实验材料，不仅收集简便、无创、数量大，含大量的exosome，为鉴定蛋白生物标志物提供物质基础，而且尿液exosome大都来源于与尿液直接接触的泌尿系统上皮细胞，特别是足细胞、各段肾小管上皮细胞和集合管细胞等，上述细胞的病理生理变化将改变其exosome的成分，为实时反映细胞状态提供可行途径，具有较广阔的应用前景。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：目前尿液exosome的检测往往无法区分其来源，因而缺乏特异性，更不能精准的监测来源细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)从新鲜收集的尿液中提取并纯化exosome，收集沉淀并重悬得到exosome悬液；(2)分别用CD13和podocalyxin包被的磁珠对步骤(1)得到的exosome悬液进行分选，得到exosome分选液；(3)将步骤(2)得到的分选液通过用BCA试剂盒测exosome的蛋白浓度；(4)根据步骤(3)得到的蛋白浓度，将各分选液制备为蛋白上样标本，将所述标本进行CD13、Podocalyxcin和CD63 western blot检测后，鉴定得到所需的蛋白标记物。

【技术特征摘要】
1.一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)从新鲜收集的尿液中提取并纯化exosome，收集沉淀并重悬得到exosome悬液；(2)分别用CD13和podocalyxin包被的磁珠对步骤(1)得到的exosome悬液进行分选，得到exosome分选液；(3)将步骤(2)得到的分选液通过用BCA试剂盒测exosome的蛋白浓度；(4)根据步骤(3)得到的蛋白浓度，将各分选液制备为蛋白上样标本，将所述标本进行CD13、Podocalyxcin和CD63westernblot检测后，鉴定得到所需的蛋白标记物。2.如权利要求1所述的尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，步骤(1)的详细步骤包括：(i)往新鲜尿液中加入蛋白酶抑制剂混合物，在4℃、17000g下离心10分钟，收集上清；所述尿液、蛋白酶抑制剂混合物的体积比为50mL：4.22mL；(ii)将步骤(i)中得到的上清在25℃、200000g下离心1小时，收集沉淀；(iii)将步骤(ii)中得到的沉淀用蔗糖分离溶液重悬后得到初级重悬液，按200mg/mL的浓度在重悬液中加入二硫苏糖醇，在95℃下加热2分钟，在25℃、200000g下离心1小时，收集的沉淀用蔗糖分离溶液重悬后得到exosome悬液。3.如权利要求2所述的尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，在步骤(i)中，所述蛋白酶抑制剂混合物包括100mMNaN3、10mMPMSF、1mMLeupeptin；在步骤(iii)中，所述蔗糖分离溶液包括10mMTriethanolamine、250mMSucrose。4.如权利要求1所述的尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，步骤(2)的详细步骤包括：(i)将20μL涡旋处理后的免疫包被磁珠与200μL分选缓冲液混匀后置于磁场环境中1分钟，弃上清，加入步骤(1)得到的exosome悬液；(ii)将exosome悬液在4℃下缓慢旋转孵育18～24小时，加入30...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨俊伟，周阳，曹红娣，熊明霞，江蕾，闻萍，方丽，何伟春，叶红，
申请(专利权)人：南京医科大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32