一种小鼠肾足细胞的分离方法技术

技术编号：41234459 阅读：4 留言：0更新日期：2024-05-09 23:49

本发明专利技术提供了一种小鼠肾足细胞的分离方法，属于细胞生物学技术领域。本发明专利技术将小鼠肾脏剪碎、使用酶消化液A进行第一消化，使用差异过筛法提取肾小球；将肾小球离心、使用酶消化液B进行第二消化，组织分离，重悬得到单细胞悬液；将单细胞悬液和生物素化抗体混合、孵育，离心，使用缓冲液2重悬，加入免疫磁珠孵育，使用缓冲液1清洗、磁分离后得到磁珠结合的细胞；将磁珠结合的细胞在缓冲液3中重悬，加入释放缓冲液孵育，释放，收集得到小鼠肾足细胞。本发明专利技术分离方法最终提取获得的肾足细胞纯度为99.6％，传统差异过筛结合酶消化法得到的肾足细胞纯度为96％，相对于现有技术，本发明专利技术磁珠提取肾足细胞法所提取到的肾足细胞纯度高，收率高。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学，尤其涉及一种小鼠肾足细胞的分离方法。

技术介绍

1、足细胞是一种结构复杂的终末分化细胞，位于肾小球基底膜外侧，参与形成肾小球滤过屏障，易受到各种损伤，出现足突消失、足细胞肥大和脱离基底膜并随尿液流失等一系列变化。足细胞损伤和丢失是蛋白尿以及肾小球疾病如糖尿病肾病和局灶节段性肾小球硬化进展的关键事件。肾小球足细胞密度是预测蛋白尿发生和进展的最佳指标。然而足细胞的损伤和死亡的机制尚不明确。

2、建立操作性好、简单易行且效率较高的小鼠肾脏足细胞分离及原代培养模式是研究足细胞的基础。目前使用较多的是差异过筛法结合酶消化法。肾小球种植5天后可见足细胞从组织中爬出，足细胞传代培养2天后可观察到细胞胞体有突起生长。小鼠肾小球的单细胞测序转录图谱确定了5个主要的细胞簇：足细胞(80％)、系膜细胞(2％)、内皮细胞(12％)、肾小管细胞(6％)和一小群免疫细胞(0.2％)。然而差异过筛法结合酶消化法分离的足细胞纯度不高。因此，急需开发一种的小鼠肾足细胞的分离方法，来提高肾足细胞的纯度。

技术实现思路

1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种小鼠肾足细胞的分离方法，以克服传统的差异过筛法结合酶消化法分离足细胞纯度不高的问题。

2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：

3、本专利技术提供了一种小鼠肾足细胞的分离方法，包括以下步骤：

4、1)将小鼠肾脏剪碎、使用酶消化液a进行第一消化，使用差异过筛法提取肾小球；</p>

5、2)将肾小球离心、使用酶消化液b进行第二消化，组织分离，重悬得到单细胞悬液；

6、3)将单细胞悬液和生物素化抗体混合、孵育，离心，使用缓冲液2重悬，加入免疫磁珠孵育，使用缓冲液1清洗、磁分离后得到磁珠结合的细胞；

7、4)将磁珠结合的细胞在缓冲液3中重悬，加入释放缓冲液孵育，释放，收集得到小鼠肾足细胞。

8、优选的，步骤1)中所述酶消化液a以hbss为溶剂，包括以下浓度的组分：0.5～1.5mg/ml胶原酶、0.2～0.8mg/ml蛋白酶e；所述第一消化的时间为10～20min。

9、优选的，步骤2)中所述酶消化液b以hbss为溶剂，包括以下浓度的组分：0.5～1.5mg/ml胶原酶、0.2～0.8mg/ml蛋白酶e、80～120u/mldna酶i；

10、所述第二消化的温度为32～40℃，所述第二消化的时间为10～20min；所述第二消化和组织分离的次数为2～5次；所述重悬的溶液为无ca2+无mg2+的pbs溶液。

11、优选的，步骤3)中所述单细胞悬液和生物素化抗体混合的比例为0.5～2ml：5～15μg；

12、所述孵育的温度为2～8℃，所述孵育的时间为5～15min。

13、优选的，步骤3)中所述缓冲液1以无ca2+无mg2+的pbs为基础，包括以下浓度的组分：终浓度为0.05～0.15％bsa；所述缓冲液1的ph为7.2～7.5；所述使用缓冲液1清洗和磁分离的次数为2～5次。

14、优选的，步骤3)中生物素化抗体和免疫磁珠的比例为5～15μg：20～30μl；

15、所述孵育的温度为2～8℃，所述孵育的时间为15～25min。

16、优选的，步骤3)中所述缓冲液2以无ca2+无mg2+的pbs为基础，包括以下浓度的组分：终浓度为0.05～0.15％bsa、终浓度为0.3～0.9％的柠檬酸钠；

17、或以无ca2+无mg2+的pbs为基础，包括以下浓度的组分：终浓度为0.05～0.15％bsa、终浓度为1～3mm的edta。

18、优选的，步骤4)中所述缓冲液3以rpmi-1640培养基为基础，包括以下浓度的组分：0.5～1.5％的fcs、0.5～1.5mm cacl2、2～7mm mgcl2；所述缓冲液3的ph为7.0～7.4。

19、优选的，步骤4)中所述释放缓冲液为dnasei；所述孵育的时间为5～15min。

20、优选的，步骤4)中所述释放用100～200μl的移液枪混匀5～10次。

21、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：

22、本专利技术先经差异过筛法提取出肾小球，加入胶原酶、蛋白酶e和dna酶i混合液消化，得到单细胞悬液，再与生物素标记的nephrin抗体孵育，进一步加入生物素磁珠，与生物素标记的nephrin抗体结合，分离得到肾足细胞，最终提取获得的肾足细胞纯度高达99.6％。

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【技术保护点】

1.一种小鼠肾足细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤1)中所述酶消化液A以HBSS为溶剂，包括以下浓度的组分：0.5～1.5mg/mL胶原酶、0.2～0.8mg/mL蛋白酶E；所述第一消化的时间为10～20min。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤2)中所述酶消化液B以HBSS为溶剂，包括以下浓度的组分：0.5～1.5mg/mL胶原酶、0.2～0.8mg/mL蛋白酶E、80～120U/mLDNA酶I；

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤3)中所述单细胞悬液和生物素化抗体混合的比例为0.5～2mL：5～15μg；

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤3)中所述缓冲液1以无Ca2+无Mg2+的PBS为基础，包括以下浓度的组分：终浓度为0.05～0.15％BSA；所述缓冲液1的pH为7.2～7.5；所述使用缓冲液1清洗和磁分离的次数为2～5次。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤3)中生物素化抗体和免疫磁珠的比例为5～15μg：20～30μL；

7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤3)中所述缓冲液2以无Ca2+无Mg2+的PBS为基础，包括以下浓度的组分：终浓度为0.05～0.15％BSA、终浓度为0.3～0.9％的柠檬酸钠；

8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤4)中所述缓冲液3以RPMI-1640培养基为基础，包括以下浓度的组分：0.5～1.5％的FCS、0.5～1.5mM CaCl2、2～7mM MgCl2；所述缓冲液3的pH为7.0～7.4。

9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤4)中所述释放缓冲液为DNaseI；所述孵育的时间为5～15min。

10.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤4)中所述释放用100～200μL的移液枪混匀5～10次。

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【技术特征摘要】

1.一种小鼠肾足细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤1)中所述酶消化液a以hbss为溶剂，包括以下浓度的组分：0.5～1.5mg/ml胶原酶、0.2～0.8mg/ml蛋白酶e；所述第一消化的时间为10～20min。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤2)中所述酶消化液b以hbss为溶剂，包括以下浓度的组分：0.5～1.5mg/ml胶原酶、0.2～0.8mg/ml蛋白酶e、80～120u/mldna酶i；

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤3)中所述单细胞悬液和生物素化抗体混合的比例为0.5～2ml：5～15μg；

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤3)中所述缓冲液1以无ca2+无mg2+的pbs为基础，包括以下浓度的组分：终浓度为0.05～0.15％bsa；所述缓冲液1的ph为7.2～7.5；所述使用缓冲液1清洗和...

【专利技术属性】
技术研发人员：江蕾，王璐璐，王海燕，
申请(专利权)人：南京医科大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：

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